甘肅省高中生物選修一教案：課題1 DNA的粗提取與鑒定

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1、 課題1 DNA的粗提取與鑒定 教材內(nèi)容解讀 要點(diǎn)1 提取DNA的方法 （1）分離 選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。 （2）DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA在NaCl溶液中的溶解度隨NaCl的濃度變化，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。選擇適當(dāng)?shù)柠}溶液就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA會(huì)析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。 （3）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性

2、 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒有影響。 （4）DNA的鑒定 在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。 要點(diǎn)2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）實(shí)驗(yàn)材料的選取 選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如雞血。 （2）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞以雞血為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。 植物細(xì)胞需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。 （3）去除濾液中的雜質(zhì) 方法有三種： ①在濾液中加入NaCl，使NaC

3、l溶液濃度為2mol/L，過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì)，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 ②直接在濾液中加入嫩肉粉反應(yīng)10～15分鐘，嫩肉粉中的木瓜蛋白質(zhì)酶能夠分解蛋白質(zhì)。 ③將濾液放在60～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15分鐘。 （4）DNA的析出與鑒定 ①析出較純凈的DNA 將處理后的溶液過(guò)濾，加入與溶液體積相等的、冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2～3分鐘，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。 ②DNA的鑒定 取兩支20mL的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液

4、5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5分鐘，待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。溶解有DNA的溶液變藍(lán)。 要點(diǎn)3 實(shí)驗(yàn)案例 案例一以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取 課前準(zhǔn)備 本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。 教師可以到市場(chǎng)售活雞處索取雞血，所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。具體制備方法如下。取質(zhì)量濃度為0.

5、1g/mL的檸檬酸鈉溶液100mL，置于500mL燒杯中，注入新鮮的雞血（約180mL），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液凝結(jié)。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，靜置1d，使血細(xì)胞自行沉淀。有條件的學(xué)校也可以將血液倒入離心管內(nèi)進(jìn)行離心，用2000r/min或3000r/min的轉(zhuǎn)速，離心2min，使血細(xì)胞沉淀于離心管底部，這樣可以使血細(xì)胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。值得注意的是雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。 提取DNA的具體步驟 1.破碎細(xì)胞，釋

6、放DNA 雞血細(xì)胞中的DNA與核蛋白結(jié)合，位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，正常情況下是不會(huì)釋放出來(lái)的。為了使DNA從細(xì)胞核中釋放出來(lái)，需要向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水，并且攪拌，從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般5～10mL的雞血細(xì)胞液加入20mL蒸餾水?dāng)嚢?min。釋放出來(lái)的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用3～4層紗布進(jìn)行過(guò)濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。 2．溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2mol/L的NaCl

7、溶液，攪拌1min。注意應(yīng)沿一個(gè)方向攪拌，使DNA充分溶解。 3．DNA的析出 將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。教材中列舉了提取DNA的三種方案，本案例選取方案一。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時(shí)應(yīng)注意控制加水量，使NaCl溶液的終濃度為0.1～0.2mol/L。加水過(guò)程一般分三次進(jìn)行，當(dāng)總加水量為300mL左右時(shí)，DNA已基本析出。加水太多、溶液過(guò)稀，會(huì)使DNA分子又重新溶解。 用3～4層紗布對(duì)DNA稀釋液進(jìn)行過(guò)濾，濾去蛋白質(zhì)，收集DNA的黏稠物。如果

8、采用離心法，效果更好。用4000r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)，離心15min，除去上清液(含有蛋白質(zhì))，留下的沉淀物中含有DNA。此時(shí)注意觀察DNA黏稠物的顏色。 4.DNA的初步純化 如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質(zhì)，或者加入溶液和攪拌等操作過(guò)程不規(guī)范，都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，常常使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色──白色。為了增進(jìn)實(shí)驗(yàn)效果，需要對(duì)DNA粗制品進(jìn)行簡(jiǎn)單的提純，下面的方案可供參考。 將DNA黏稠物再溶解，繼續(xù)用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個(gè)方向不停攪拌3min，使DNA充分溶解，以免損失。用3～4層紗布進(jìn)行過(guò)濾（或離心），濾去雜

9、質(zhì)，收集含有DNA的濾液。向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，并用玻璃棒朝一個(gè)方向緩慢、均勻地?cái)嚢瑁芤褐袝?huì)出現(xiàn)DNA絲狀物。 實(shí)驗(yàn)一般要求采用預(yù)冷的95％的乙醇，但對(duì)比結(jié)果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生明顯效果。從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。此時(shí)懸浮于溶液中的DNA絲狀物相對(duì)含雜質(zhì)較少，如果出現(xiàn)的絲狀物較少，可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘。濃縮后的DNA絲狀物，可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起(因?yàn)椴ＡО粲形紻NA的作用)。如果D

10、NA絲狀物較少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具來(lái)幫助DNA分子纏繞。 DNA的純化還有許多其他方法。例如，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。隨后，加入氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1），通過(guò)離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去,取上清液?？芍貜?fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性存在于酚層中，這時(shí)可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開。教師可以根據(jù)學(xué)校的條件讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 5．DNA的鑒定 二苯胺法二

11、苯胺試劑的配制及鑒定DNA的方法參見教科書。需要注意的是，二苯胺試劑在冰箱內(nèi)可保存6個(gè)月，使用前需搖勻。 紫外燈照射法用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260nm處)。 電泳法此方法適合鑒定純度較高的DNA。有條件的學(xué)?？梢詤⒖急緦ｎ}課題2的實(shí)驗(yàn)案例和參考資料部分。 案例二以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取 課前準(zhǔn)備將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h。 提取DNA的具體步驟 1.取材稱取3

12、0g菜花，去梗取花，切碎。 2.研磨將碎菜花放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。 研磨液的配制方法如下。將10.1gTris（三羥甲基氨基甲烷）加入到50mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2moL/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定容至1000mL。 教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細(xì)胞膜破碎，釋放DNA。學(xué)生可以設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA都采用一種陽(yáng)離子去污劑──十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液，使細(xì)胞膜破碎，

13、同時(shí)將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開，再用氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1）抽提去除雜質(zhì)蛋白，得到高純度的DNA。 3.過(guò)濾在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過(guò)濾到燒杯中(有條件的學(xué)?？蓪V液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000r/min的轉(zhuǎn)速，離心2～5min，取上清液放入燒杯中)。在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。 4.沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95％的預(yù)冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤?玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀3～5min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 要點(diǎn)4 疑難解答 （1）為什么加入蒸餾

14、水能使雞血細(xì)胞破裂？ 蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。 （2）在切碎的洋蔥加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？ 洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 （3）提取洋蔥DNA時(shí)如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？ 研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 （4）為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜

15、質(zhì)？ 用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。 要點(diǎn)5 參考資料 1.二苯胺鑒定DNA的化學(xué)原理 DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍(lán)色(溶液呈淺藍(lán)色)。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。 2.研磨液中幾種藥品的作用 Tris/HCl:提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)（Tris為三羥甲基氨基甲烷）。 EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：是DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA。 SDS（十二烷基磺酸鈉）：可以使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。