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1、1,醫(yī)療器械微生物限度檢驗(yàn),2,概述,微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。,微生物限度檢查,細(xì)菌、真菌菌落數(shù),控制菌,3,概述,微生物：形體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通常要用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物 特點(diǎn)： 1、個(gè)體微小，一般0.1mm 2、構(gòu)造簡(jiǎn)單，有單細(xì)胞的，簡(jiǎn)單多細(xì)胞 的，非細(xì)胞的 3、進(jìn)化地位低 分類：原核類：二菌，四體（細(xì)菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體） 真核類：真菌，原生動(dòng)物，顯微藻類 非細(xì)胞類：病毒，亞病毒,4,5,概述,醫(yī)療用品的分類 按醫(yī)療用品與人體接觸的性質(zhì)以及對(duì)人體使用安全性要求分三類： a) 類醫(yī)療用品：接觸人體
2、完整皮膚的醫(yī)療用品 b) 類醫(yī)療用品：接觸人體未破損粘膜的醫(yī)療用品 c) 類醫(yī)療用品：進(jìn)入人體無(wú)菌組織、器官和血液 以及接觸破損皮膚和粘膜的醫(yī)療 用品,6,常用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),中華人民共和國(guó)藥典 2010年版二部附錄XI J “微生物限度檢查法” GB 15979-2002 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)附錄B ISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methodsPart1: Determination of a population of microorganisms on products,7,8,實(shí)驗(yàn)條件,無(wú)菌
3、操作技術(shù) 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 實(shí)驗(yàn)器材,9,無(wú)菌操作技術(shù),微生物學(xué)基礎(chǔ) 微生物實(shí)踐基礎(chǔ) 無(wú)菌操作意識(shí),10,實(shí)驗(yàn)環(huán)境,潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域或隔離系統(tǒng)； 定期按GB/T16292-16294：2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證； 實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控：實(shí)驗(yàn)時(shí)將制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板打開放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束收起，30 35培養(yǎng)48h，菌落平均數(shù)應(yīng)小于1cfu/90mm。,11,實(shí)驗(yàn)器具,儀器 超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、薄膜過(guò)濾裝置、比濁儀等。 用具 試管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密PH試
4、紙、濾膜、濾杯、剪刀、鑷子、無(wú)菌服、牛皮紙等。,12,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證 實(shí)驗(yàn)試液 培養(yǎng)基 滅菌方法,13,實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證,環(huán)境清潔，表面消毒（ 75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1:1000)溶液或其他適宜消毒溶液） 空氣過(guò)濾系統(tǒng)，紫外燈或臭氧空氣消毒儀,14,實(shí)驗(yàn)試液,稀釋劑 1.0.9%氯化鈉溶液 2.pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 3.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液：調(diào)解pH至近中性，其中蛋白胨對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有保護(hù)作用有利于菌落數(shù)及控制菌測(cè)定。 表面活性劑、中和劑或滅活劑 鑒定用試劑 1.靛基質(zhì)試液 2.1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液（氧化酶試液） 3.三氯甲烷 4.
5、1mol/l鹽酸試液,15,培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)菌株處理及增菌用培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,16,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細(xì)菌生長(zhǎng)要求。應(yīng)按各種培養(yǎng)基要求準(zhǔn)確測(cè)定調(diào)節(jié)pH值。多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的適宜pH值為7.27.6。酵母菌霉菌（6.06.5）。調(diào)節(jié)可用1N HCl或NaOH。 培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，應(yīng)按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營(yíng)養(yǎng)成分。 制成的培養(yǎng)基應(yīng)透明，以便觀察細(xì)菌生長(zhǎng)性狀以及其他代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。,17,滅菌方式,濕熱：115 121 ，15min30min 物品切勿立即取出置冷處，以免急速冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸氣冷凝造成負(fù)壓，以致染菌。 干熱：16
6、0 170 ，2h 適于耐高溫的玻璃、陶瓷或金屬器皿的滅菌。 滅菌程序需要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。,18,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。,19,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,菌種 大腸埃希菌 CMCC（B）44 102 金黃色葡萄球菌 CMCC（B） 26 003 枯草芽孢桿菌 CMCC（B） 63 501 白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 黑曲霉 CMCC(F) 98 003 驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物
7、學(xué)特性。,20,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,菌液制備 取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物（一般18h24h，白念24h48h ，黑曲霉 57天 ），用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)50cfu100cfu的菌懸液 （黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液）； 菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2 8可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 8，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。,21,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種 金黃色葡萄球菌2個(gè)平皿 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 大腸埃希菌2個(gè)平皿 枯草芽孢桿菌2個(gè)平皿 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 白色念珠菌2個(gè)平皿 黑典霉2個(gè)平皿 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：
8、白色念珠菌2個(gè)平皿 用相同的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基做對(duì)照,22,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,結(jié)果判定 若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。,23,樣品準(zhǔn)備,供試品進(jìn)入無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)作表面消毒，用適宜的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒。 檢驗(yàn)數(shù)量：應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。,24,樣品準(zhǔn)備,檢驗(yàn)量：除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10 g或10ml；化學(xué)膜劑100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品
9、的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。,25,供試液制備,液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品 取10ml或10g用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌吐溫80使供試品分散均勻; 水溶性液體亦可用混合供試品原液作為供試液； 非水溶性供試品 ：乳化或萃取; 膜劑供試品 ：取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml浸泡，振搖，作為1：10的供試液; 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品：取供試品10g ，加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶
10、制劑)PH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液; 氣霧劑、噴霧劑供試品 ，經(jīng)處理后同第一項(xiàng)制備供試液; 貼劑供試品 具抑菌活性的供試品 ：培養(yǎng)基稀釋法 、離心沉淀法 、薄膜過(guò)濾法 、中和法;,26,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)方法 傾注平皿法 薄膜過(guò)濾法 培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基,27,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù) 霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù) 必要時(shí)可延長(zhǎng)至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) 點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀
11、釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù),28,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),方法驗(yàn)證 （1）試驗(yàn)組 平皿法：供試液1ml +1ml 試驗(yàn)菌菌懸液，平行制備2個(gè)平皿，菌落計(jì)數(shù)； 薄膜過(guò)濾法：供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入1ml試驗(yàn)菌，過(guò)濾，菌落計(jì)數(shù)； （2）菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)； （3）供試品對(duì)照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)； （4）稀釋劑對(duì)照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。稀釋劑+試驗(yàn)菌菌懸液；,29,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的
12、平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。 結(jié)果判斷 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%； 若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率均不低于70%，可照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)； 若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和 法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。,30,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),1.平皿法 采用平皿法進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定時(shí)，應(yīng)取適宜的連續(xù)23個(gè)稀釋級(jí)的供試液。 取供試液1ml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入1520ml 溫度不超過(guò)45的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰
13、紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。,31,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),營(yíng)養(yǎng)瓊脂-細(xì)菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基-霉菌,32,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),1.平皿法 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則： 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)； 以最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)； 如果各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或
14、僅是最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。,33,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),2. 薄膜過(guò)濾法 取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品每1g或1ml 所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml ，過(guò)濾。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，照上述薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。,34,細(xì)菌、
15、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),2. 薄膜過(guò)濾法 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾 1g或1ml供試品），或1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。,35,細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)較高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。,36,37,控制菌檢查法驗(yàn)證,菌種（菌液制備同前） 大腸埃希菌 CMCC
16、（B）44 102 金黃色葡萄球菌 CMCC（B） 26 003 乙型副傷寒沙門菌CMCC（B） 50 094 銅綠假單胞菌 CMCC（B） 10 104 生孢梭菌 CMCC(B) 64 941,38,控制菌檢查法驗(yàn)證,（1）試驗(yàn)組 取規(guī)定量供試液及10cfu100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 （2）陰性菌對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃
17、色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。 結(jié)果判斷 陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法 、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。,39,大腸埃希菌檢驗(yàn),取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。 取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG
18、培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽(yáng)性，不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。,40,大腸埃希菌檢驗(yàn),MUG 靛基質(zhì)試驗(yàn),41,大腸埃希菌檢驗(yàn),如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，均應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上
19、，培養(yǎng)1824小時(shí)。 若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌 。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。,42,大腸埃希菌檢驗(yàn),大腸埃希菌菌落形態(tài)特征,43,大腸菌群檢驗(yàn),取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或 0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或 0.01ml ）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或 0.001ml），另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作
20、為陰性對(duì)照管。培養(yǎng)1824小時(shí)。,44,大腸菌群檢驗(yàn),膽鹽乳糖發(fā)酵管若無(wú)菌生長(zhǎng)、或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。 若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無(wú)芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。,45,大腸菌群檢驗(yàn),大腸菌群落形態(tài)特征,46,大腸菌群檢驗(yàn),確證試驗(yàn) 從上述分離平板上挑選45個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，
21、判該乳糖發(fā)酵管檢 出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按下表報(bào)告1g或1ml供試品 中的大腸菌群數(shù)。,47,可能的大腸菌群數(shù)表,48,沙門菌檢驗(yàn),取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)1824小時(shí)。 取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至4048小時(shí)）。 若平板上無(wú)菌生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列的特征，判供試品未檢出
22、沙門菌。,49,沙門菌檢驗(yàn),沙門菌菌落形態(tài)特征,50,沙門菌檢驗(yàn),若平板上生長(zhǎng)的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無(wú)黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。,51,銅綠假單胞菌檢驗(yàn),取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的
23、平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無(wú)定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。,52,銅綠假單胞菌檢驗(yàn),氧化酶試驗(yàn) 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配置的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。 若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌或
24、氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。 綠膿菌素試驗(yàn) 取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，加三氯甲烷35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/l鹽酸試液約1ml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。 若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是
25、否為銅綠假單胞菌。,53,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824
26、小時(shí)，作血漿凝固酶試驗(yàn)。,54,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征,55,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),血漿凝固酶試驗(yàn) 取滅菌小試管3支，各加入血漿和 無(wú)菌水混合液（1：1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管。將3管同時(shí)培養(yǎng)，3小時(shí)后開始觀察直至24小時(shí)。陰性對(duì)照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如，陽(yáng)性 對(duì)照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。如陽(yáng)
27、性對(duì)照管或陰性對(duì)照管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。,56,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn),若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。,57,梭菌檢驗(yàn),取供試液10ml （相當(dāng)于供試品1g，1ml）2份，其中1份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的0.1%新鮮庖肉培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)。再取上述培養(yǎng)物0.2ml，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)4872小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。
28、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過(guò)氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。 若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢，過(guò)氧化氫酶陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。,58,白色念珠菌檢驗(yàn),取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4872小時(shí)，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)。 菌落特征：乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深，質(zhì)地變硬或有皺褶。 若平板上無(wú)
29、菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于上述特征，判供試品未檢出白色念珠菌。 若平板上生長(zhǎng)的菌落與上述特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落，分別接種念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)。若平板上無(wú)綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。 若有綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，則挑取相符或疑似菌落接種于1%聚山黎脂80-玉米瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2448小時(shí)，進(jìn)行染色鏡檢及芽管試驗(yàn)。 若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。,59,結(jié)果判斷,供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。 供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。 眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí)，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定。 若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。,60,謝謝大家！,知識(shí)回顧Knowledge Review,
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