生物芯片的制造及其應(yīng)用

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1、基因芯片的制造及其應(yīng)用,夏詠梅 2008.11.03,基本概念回顧 基因芯片的制備技術(shù) 基因芯片的應(yīng)用,我是不聽她上化學(xué)課的，你們看著辦吧！,1. 基本概念回顧 just for chemistry people,核酸包括DNA和RNA兩大類。 DNA 核苷酸中的嘌呤堿(purine)主要是鳥嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)，嘧啶堿(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；

2、而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。 嘌呤和嘧啶環(huán)中含有共軛雙鍵，對260nm左右波長的紫外光有較強的吸收。堿基的這一特性常被用來對堿基、核苷、核苷酸和核酸進(jìn)行定性和定量分析。,guanine,adenine,cytosine,uracil,thymine,purine,pyrimidine,(1)同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同； (2)一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變； (3)幾乎所有的DNA，無論種屬來源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同(A=T)，鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同(G=C)，總的嘌呤摩爾含量與總的嘧啶摩爾

3、含量相同(AG=CT)； (4)不同生物來源的DNA堿基組成不同，表現(xiàn)在(AT)/(GC)比值的不同。,DNA的二級結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu) (double helix model),DNA的半保留復(fù)制 (semiconservative replication),Oligonucleotide,Hybridization Tm=69.30.41(%G+C),.變性、復(fù)性和雜交。粗細(xì)線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈; .突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體； 虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡; .粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標(biāo)記。,核酸雜交及其應(yīng)用示意圖,RN

4、A的結(jié)構(gòu)與功能,DNA是遺傳信息的載體，遺傳信息的作用通常由蛋白質(zhì)的功能來實現(xiàn)，但DNA并非蛋白質(zhì)合成的直接模板，合成蛋白質(zhì)的模板是RNA。正常細(xì)胞遺傳信息的流向是： 反轉(zhuǎn)錄作用(reverse transcription) 與DNA相比，RNA種類繁多，分子量相對較小，一般以單股鏈存在，但可以有局部二級結(jié)構(gòu)RNA堿基組成之間無一定的比例關(guān)系，且稀有堿基較多。此外，tRNA還具有明確的三級結(jié)構(gòu)。,注：原核細(xì)胞不含后3種RNA,,RNA的分類,注：原核細(xì)胞不含后3種RNA,miRNA和siRNA的基本介紹及區(qū)別,siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。SiRNA的

5、形成主要由Dicer和Rde-1(RNAi缺陷基因-1)調(diào)控完成。只降解與其序列互補配對的mRNA。 MicroRNA（miRNA,微RNA）即為長度為22nt左右的5端帶磷酸基團(tuán)、3端帶羥基的非蛋白編碼的調(diào)控小RNA家族。miRNA廣泛存在于真核生物中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質(zhì)，一般長20-24nt，miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，在RNase酶切后以雙鏈形式存在，最后釋放互補鏈，miRNA成熟。成熟的miRNA 5端的磷酸基團(tuán)和3端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標(biāo)志。miRNA的又一特點基因表達(dá)時序性。MiRNA表達(dá)的時序性和組織特異性提示人們miRNA的分布

6、可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種 。 人類基因組中大約有255個編碼miRNA基因，約占人類基因數(shù)的1%，但尚不清楚其功能。最近科學(xué)家發(fā)現(xiàn)小RNA 與epigenetic現(xiàn)象有聯(lián)系。所謂epigenetic 是指并不涉及遺傳序列的特征性的遺傳改變。有人已試圖將小RNA 用于抗病毒治療之用,認(rèn)為它們有可能抑制HIV21 和灰質(zhì)類病毒丙型肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄,以及也可能用于腫瘤的治療。,miRNA與siRNA的不同點,1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而siRNA是人工體外合成

7、的，通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNAi的中間產(chǎn)物。 2.結(jié)構(gòu)上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。 3.Dicer酶對二者的加工過程不同，miRNA是不對稱加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個側(cè)臂，其他部分降解；而siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。 4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。 5.在作用方式上，miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。 6.miRNA主要在發(fā)育過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源

8、基因表達(dá)，而siRNA不參與生物生長，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。,miRNA Detection and Expression Profiling,What are the differences between miRNA and mRNA,miRNAs are too short to allow the alternative probe sequence selections miRNAs do not have polyA tail to initiate cDNA synthesis miRNA labeling requires different s

9、trategy miRNAs short lengths give more dispersed hybridization affinity and thus signal strength,,,Formation of miRNA,Micro RNA (miRNA) is endogenous and present across species. Primary miRNA transcripts (Pri-miRNAs) are processed by RNase III enzyme, Drosha, to generate 70 to 100 nucleotides (nt) h

10、airpin precursors (Pre-miRNAs). Pre-miRNAs are then further processed by another RNase III enzyme, Dicer, to yield mature miRNAs, ranging from 17 to 24 nt in length. miRNAs are incorporated into the RNA interference (RNAi) effector complex, RISC, and target specific messenger RNAs (mRNA) for transla

11、tional repression or mRNA cleavage. Therefore, miRNAs play an important role in regulating gene expression.,From Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297 (2004),,PCR,核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈核酸在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈

12、。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡雜交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。其基本過程包括下列幾個步驟。 （1）制備樣品：首先從待檢測組織提取DNA或RNA。 DNA應(yīng)先用限制性內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長度的片段，然后通過凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進(jìn)行分離。一般來說DNA分子有其獨特的限制性內(nèi)切酶圖譜，所以經(jīng)酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區(qū)帶。再將含有DNA片段的凝膠進(jìn)行變性處理后，直接轉(zhuǎn)印到支持膜上并使其牢固結(jié)合。這樣等檢測片段在凝膠

13、上的位置就直接反映在了轉(zhuǎn)印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉(zhuǎn)印并交聯(lián)固定。 （2）制備探針：探針是指一段能和待檢測核酸分子依堿基配對原則而結(jié)合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探針需要被標(biāo)記上可直接檢測的元素或分子。 （3）雜交：先要進(jìn)行預(yù)雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。由于轉(zhuǎn)印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以雜交過程中只需變性標(biāo)記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應(yīng)，然后洗去未結(jié)合的探針分子即可。 （4）檢測：檢測的方法依標(biāo)記探針的方法而異。用放射性同位素標(biāo)記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置；而如果是用生物素

14、等標(biāo)記的探針則需要用相應(yīng)的免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測。,基因診斷的方法,與疾病相關(guān)的遺傳背景改變主要有兩類，一是遺傳物質(zhì)，即DNA或RNA的水平變化。二是遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，即基因突變，如點突變引起的基因失活，及染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。所以理論上說檢測基因水平或結(jié)構(gòu)的方法都應(yīng)可用于基因診斷。,組織中總RNA的提取 利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA PCR反應(yīng)： 反應(yīng)液組織：反應(yīng)緩沖液 模板（上述合成的cDNA） 底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物（例如某種病毒特異性引物） TaqDNA聚合酶 循環(huán)：95，30sec（變性） 55，1min（退火）30 or more 循環(huán)

15、 72，1min（聚合） 檢測：電泳或核酸雜交,PCR用于病毒感染的基因診斷,在優(yōu)化的條件下，核酸雜交可檢測到pg水平的靶分子，約相當(dāng)于106個分子。 但是在許多臨床情況下，無法得到這樣的樣品量。用PCR來特異性地增加靶分子量，提高敏感性。,2. 基因芯片的制備技術(shù),生物芯片技術(shù)通過微加工工藝在厘米見方的芯片上集成有成千上萬個與生命相關(guān)的信息分子，它可以對生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)中的各種生物化學(xué)反應(yīng)過程進(jìn)行集成，從而實現(xiàn)對基因、配體、抗原等生物活性物質(zhì)進(jìn)行高效快捷的測試和分析。 生物芯片由于采用了微電子學(xué)的并行處理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出優(yōu)點。 生物芯片的設(shè)想最早起始于80年代中

16、期，90年代美國Affymetrix公司實現(xiàn)了DNA探針分子的高密度集成，即將特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一塊玻璃、硅等固體片基上，作為核酸信息的載體，通過與樣品的雜交反應(yīng)獲取其核酸序列信息。Affymetrix公司生物芯片的市場占有率超過50%。 2002年, Nimblegen公司、 Xeotron開始提供光引發(fā)原位合成微點陣（microarray）芯片。 Xeotron公司，微流體 (microfluidic array)芯片; 2004年，Atantic、LC-Science; 2006年，LC-Bio; 2008年，LC-Genetics。,按用途分可分為檢測芯片和

17、反應(yīng)芯片；其形式主要為微點陣芯片。 僅就目前的發(fā)展情況，微點陣芯片主要包括DNA微點陣芯片（又稱基因芯片或DNA芯片）、蛋白或多肽微點陣芯片和組織芯片?；谄渌锎蠓肿犹禺愋韵嗷プ饔玫纳镄酒矔嗬^問世。組織芯片不能用原位合成的方法制作。所謂DNA微點陣芯片是指同時將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特異性對DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效率的解讀和分析，以用于基因表達(dá)譜的檢測、突變篩查、DNA多肽性分析、DNA測序和基因組文庫作圖等研究。 已有多種方法可以將寡核苷酸固定到固相支持物上。這些方法總體上分為兩種：原位合成(in situ synthesis)與合成后以微

18、量點樣技術(shù)點樣。可用許多先進(jìn)的固定技術(shù)進(jìn)行制備同時也可實現(xiàn)自動化生產(chǎn)。都適于以玻片為支持物的芯片制作但有各自的優(yōu)缺點。原位合成的具體方案有光引導(dǎo)原位合成(light- directed in situ synthesis)、壓電打印原位合成以及分子印章技術(shù)等。,微點陣生物芯片的制作方法,點樣法在多聚物的設(shè)計方面與原位合成技術(shù)相似。只是合成工作用傳統(tǒng)的DNA、多肽合成儀或PCR擴(kuò)增或體內(nèi)克隆等方法完成。大量制備好的核酸探針、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自動化微量點樣裝置將其以較高密度互不干擾地印點于經(jīng)過特殊處理的玻片、尼龍膜、硝酸纖維素膜上，并使其與支持物牢固結(jié)合。支持物需預(yù)先經(jīng)過特殊處理，

19、例如多聚賴氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共價結(jié)合的方法將這些生物大分子牢牢地附著于支持物上?，F(xiàn)在已經(jīng)有比較成型的點樣裝置出售，例如美國Biodot公司的“噴印”儀以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”儀。這些自動化儀器依據(jù)所配備的“打印”或“噴印”針將生物大分子從多孔板吸出直接“打印”或“噴印”于芯片片基上(Fig2)?！按蛴　睍r針頭與芯片片基表面發(fā)生接觸而“噴印”時針頭與片基表面保持一定的距離。所以“打印”儀適宜制作較高密度的微陣列（例如2500點/cm2），“噴印”法由于“噴印”的斑點較大，所以只能形成較低密度的探針陣列，通常400點/c

20、m2。點樣法制作芯片的工藝比較簡單便于掌握、分析設(shè)備易于獲取，適宜用戶按照自己的需要靈活機動地設(shè)計微點陣，用于科研和實踐工作。,點樣法,分子印章技術(shù)與上述兩種方法在合成原理上相同，區(qū)別僅在于該技術(shù)利用預(yù)先制作的印章將特定的合成試劑以印章印刷的方式分配到支持物的特定區(qū)域。后續(xù)反應(yīng)步驟類似與壓電打印原位合成技術(shù)。分子印章類似于傳統(tǒng)的印章，其表面依照陣列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此將不同的核酸或多肽合成試劑按印到芯片片基特定位點進(jìn)而進(jìn)行合成反應(yīng)。選擇適當(dāng)?shù)暮铣身樞?、設(shè)計凹凸位點不同的印章即可在支持物上原位合成出位置和序列預(yù)定的寡核苷酸或寡肽陣列。從這一點上講，分子印章原位合成技術(shù)與壓電打印原

21、位合成技術(shù)更為相似。分子印章除了可用于原位合成外還可以點樣方式制作微點陣芯片。例如已有人將分子印章技術(shù)用于蛋白微點陣芯片的制作。 以上三種原位合成技術(shù)所依據(jù)的固相合成原理相似，只是在合成前體試劑定位方面采取了不同的解決辦法，并由此導(dǎo)致了許多細(xì)節(jié)上的差異。但三種方法合成時都必需解決的問題是必需確保不同聚合反應(yīng)之間的精確定位，這一點對合成高密度寡核苷酸或多肽陣列尤為重要。同時，由于原位合成每步合成產(chǎn)率的局限較長(50nt)的寡核苷酸或寡肽序列很難用這種方法合成。但是，由于原位合成的短核酸探針陣列具有密度高、雜交速度快、效率高等優(yōu)點，而且雜交效率受錯配堿基的影響很明顯，所以原位合成的DNA微點陣適合

22、于進(jìn)行突變檢測、多態(tài)性分析、表達(dá)譜檢測、雜交測序等需要大量探針和高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的實驗。,分子印章原位合成,打印原位合成 壓電打印原位合成的方式類似于噴墨打印機，合成原理與傳統(tǒng)的核酸或寡肽固相合成技術(shù)相同。合成過程為：合成前以與光引導(dǎo)原位合成類似的方式對芯片片基進(jìn)行預(yù)處理，使其帶有反應(yīng)活性基團(tuán)，例如伯氨基。同時，將合成用前體分子（DNA合成堿基、cDNA和其它分子）放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動控制打印噴頭在芯片支持物上移動，并根據(jù)芯片不同位點探針序列需要將特定的堿基合成前體試劑（不足納升）噴印到特定位點。 噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。由于

23、脫保護(hù)方式為酸去保護(hù)，所以每步延伸的合成產(chǎn)率可以高達(dá)99%，合成的探針長度可以達(dá)到4050nt。以后每輪偶聯(lián)反應(yīng)依據(jù)同樣的方式將需要連接的分子噴印到預(yù)定位點進(jìn)行后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)。類似地重復(fù)此操作可以在特定位點按照每個位點預(yù)定的序列合成出大量的寡核苷酸探針。,目前，除了Affymetrix公司、Xeotron及Nimblegen等個別公司使用原位合成技術(shù)制造芯片外，大多中小型公司普遍采用點樣技術(shù)制作生物芯片。,Fig 2. Printing device and the tips.,原位合成具有合成速度快、相對成本低、便于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點。照相平板印刷技術(shù)是平板印刷技術(shù)與DNA和多肽固相化學(xué)合成技

24、術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，可以在預(yù)設(shè)位點按照預(yù)定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸。 Affymetrix公司運用該技術(shù)制造大規(guī)模集成的基因芯片。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子與玻片共價連接。它用預(yù)先制作的蔽光板和經(jīng)過修飾的4種堿基，通過光進(jìn)行活化從而以固相方式合成微點陣。合成前，預(yù)先將玻片氨基化，并用光不穩(wěn)定保護(hù)劑將活化的氨基保護(hù)起來。聚合用單體分子一端活化另一端受光敏保護(hù)劑的保護(hù)。選擇適當(dāng)?shù)膿豕獍澹╩ask）使需要聚合的部位透光，不需要發(fā)生聚合的位點蔽光。這樣，光通過擋光板照射到支持物上，受光部分的氨基解保護(hù)，從而與單體分子發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。每次反應(yīng)在成千上萬個位點上添加一個特定的堿基。由于發(fā)生反應(yīng)后的部

25、位依然接受保護(hù)劑的保護(hù)，所以可以通過控制擋光板透光與蔽光圖案以及每次參與反應(yīng)單體分子的種類，就可以實現(xiàn)在特定位點合成大量預(yù)定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于每步的合成產(chǎn)率較低（95%），合成30nt的終產(chǎn)率僅為20%，所以該技術(shù)只能合成30nt左右長度的寡核苷酸（Fig1）。Michigan大學(xué)、Huston大學(xué)以及Xeotron公司，將光引導(dǎo)合成技術(shù)與半導(dǎo)體工業(yè)所用的光敏抗蝕技術(shù)相結(jié)合，以光不穩(wěn)定保護(hù)的酸作為去保護(hù)劑，將每步合成產(chǎn)率提高到98-99%。,光引導(dǎo)原位合成,Affimatrix or Nimblegen Chips,,Parallel synthesis of oligonucle

26、otides,如前所述，Michigan 芯片技術(shù)同Affymetrix及Nimblegen芯片技術(shù)類似，都是采用光引發(fā)原位合成技術(shù)制造芯片，其合成化學(xué)都是用亞磷酰胺偶聯(lián)-酸脫保護(hù)法。其不同點在于，Affymetrix用光不穩(wěn)定保護(hù)劑將待反應(yīng)堿基的氨基保護(hù)起來，用金屬mask將不需要反應(yīng)的堿基位置屏蔽掉光；而Michigan 芯片以光不穩(wěn)定保護(hù)的酸作為脫保護(hù)劑，用計算機產(chǎn)生的圖象作為mask將不需要反應(yīng)的堿基位置屏蔽掉光。以合成45nt的DNA芯片為例，全合成過程需要約168步偶聯(lián)反應(yīng)，即需要168個mask。所以Michigan 芯片技術(shù)與Affymetrix相比，不僅產(chǎn)率高（如前所述，98

27、%對95%），可以用于制作45nt以上的芯片，而且成本低。,光引發(fā)原位合成微流控芯片制作技術(shù),Oligonucleotide Synthesis,,LC Sciences,Affymetrix,Microfluidic chip (appearance),Individual synthesis controlled by addressable light illumination on target reactors Highly miniaturized chip, 2cmX2cm 4000 individual microreactors! Need uniform reagent s

28、upply Ask for proper design to eliminate the usage of photomask-guided photolithography thus, reducing the cost considerably; yet maintaining flexibility in design, and feasibility for massively parallel in situ synthesis in our three-dimensional chambers on microfluidic chips .,CONCLUSION Microarr

29、ays have emerged as a useful tool to understand and correlate gene sequences and their related functions; to extend our knowledge to the proteomic level and to utilize it to capture more information. Our technology enables us to manufacture flexible, high-performance and cost effective microarrays o

30、f high fidelity, based on our platform that combines massively parallel light-gated in situ synthesis process, digital photolithography and microfluidic technology. Combined with the above technological advantages, OligoArray 2.0, our oligonucleotide design software and OligoArrayDb, our database of

31、 predesigned oligonucleotides, allows expression analysis at the genome scale for any organism for which the genome sequence is known, without relying on cDNA or oligonucleotide libraries.,REFERENCES: 1. Gao X. et al, A Flexible light-directed DNA Chip Synthesis Gated By Deprotection Using Solution

32、Photogenerated Acids, Nucleic Acids Research, 29, 4744-4750 (2001). 2. Gao X. et al, Oligonucleotide Synthesis Using Solution Photogenerated Acids, Journal of American Chemical Society, 120, 12698-9 (1998). 3. Komolpis K. et al, Light-directed Simultaneous of Oligopeptides on Microarray Substrate Us

33、ing a Photogenerated Acid, Biotechnology Progress, 18, 641-646 (2002). 4. Leproust E. et al, Digital Light-Directed Synthesis: A Microarray Platform That Permits Rapid Reaction Optimization on a Combinatorial Basis, Journal of Combinatorial Chemistry, 2, 349-354 (2000). 5. Pellois J. P. et al, Indiv

34、idually Addressable Parallel Peptide Synthesis on Microchips, Nature Biotechnology, 20, 922-926 (2002). 6. Rouillard J. M. et al, OligoArray: Genome-Scale Oligonucleotide Design for Microarrays, Bioinformatics, 18, 486-7 (2002).,OLIGONUCLEOTIDE DESIGN FOR DNA MICROARRAYS: A THERMODYNAMIC APPROACH Ou

35、r technology of DNA synthesis on chips combined with the availability of an increasing number of sequenced genomes, have prompted us to implement a software to design specific oligonucleotides for microarrays. Ideally, such oligonucleotides should be totally specific to their respective targets to a

36、void any cross-hybridization and should not form stable secondary structures that may interfere with the labeled probes during hybridization. We have developed OligoArray (Rouillard et al, 2002), a program to design specific oligonucleotides at genome scale. The latest version, OligoArray 2.0 (Rouil

37、lard et al. submitted), uses a thermodynamic approach to predict secondary structures and calculate the specificity of a probe on the chips to a unique target in a mixture of labeled targets.,PANGENOMIC DATABASE OF OLIGONUCLEOTIDES We have used our OligoArray 2.0 software to design pangenomic sets o

38、f oligonucleotides devoted to gene expression analysis for most of the organisms with a sequenced genome. As of today, we have designed 774,642 oligonucleotides representing 277,976 transcripts from 80 organisms (14 archaea, 59 bacteria and 7 eucaryotes including Homo sapiens and some genetic models

39、). We have successfully designed at least one oligonucleotide for more than 99% of all transcripts from all organisms processed and there is at least one specific oligonucleotide for 94% of these transcripts. All these oligonucleotide sets are stored into OligoArrayDb, a public database that allows

40、not only to retrieve a complete set of oligonucleotides, but also to build subsets according to user defined keywords (Rouillard et al, submitted). Supplementary information: http://berry.engin.umich.edu/oligoarraydb,,Our In-House Light Generated Oligonucleotide Synthesizer Left: Reagent Delivery Sy

41、stem Down: Optical Setup,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ideas . Oligo arrays mRNAs, miRNAs Peptide arrays proteins, kinases, antibodies Aptamer arrays proteins, metabolic molecules Designer proteins DNA oligos for genes Pico-liter

42、titer arrays quantitative data,INPUT,Computer generated light patterns Conventional chemistry for array synthesis,,Picoarray synthesis: Digital photolithography,,聚焦掃描和CCD掃描儀 一旦熒光標(biāo)記樣品和微陣列結(jié)合后，未結(jié)合的成分就可洗去，結(jié)合到芯片的樣品可通過熒光檢測裝置進(jìn)行檢測。聚焦掃描儀和CCD相機均已成功地應(yīng)用于芯片的檢測。聚焦掃描主要是利用玻璃基質(zhì)小區(qū)域（約100um2）的激光發(fā)曬透鏡（或兩者）使整個影像聚集，每個位點上帶熒

43、光的樣品發(fā)射的光通過一系列的反光鏡，光片和晶體后與不要的光分開，然后被光電倍增管（或一種類似的裝置）轉(zhuǎn)換成一種電信號。聚焦掃描聚焦數(shù)據(jù)的速度（1-5min）要比傳統(tǒng)實驗中的放射自顯影快的多（1-10天），快速的熒光檢測技術(shù)是芯片檢測技術(shù)的一次革命。CCD相機利用許多與聚焦掃描儀相同的原理聚焦熒光影像。,生物芯片的檢測,Total RNA (tissue, cell line, etc.),,,small RNA,large RNA,,Microarray detection of miRNAs,Small RNAs are enriched to reduce the background (

44、or cross-hybridization) signal from large RNAs,miRNA sample preparation and probes on chip,,,Hybridization Station,激光共聚焦生物芯片掃描系統(tǒng)SCANARRAY4000/SCANARRAY5000, 全范圍高能量激光光源，波長范圍廣 高達(dá)十種檢測濾光片，涵蓋所有生物芯片熒光檢測 掃描精度可從5um,10um,30um,50um分級調(diào)整快速全玻片范圍掃描時間僅需5分鐘 專利設(shè)計之實時激發(fā)及檢測光路校正，確保儀器間和儀器內(nèi)的時間溫度最小漂移,共聚焦掃描光學(xué)系統(tǒng),DNA化學(xué)合成

45、-乙腈亞磷酸胺法,一般由3-5進(jìn)行合成的, 3的第一個堿基結(jié)合在Glass(Controlled Pore Glass,CPG)上 Step1：脫保護(hù)。對在CPG單體上附加的第一個堿基進(jìn)行脫保護(hù)（DMT基）反應(yīng)，用以準(zhǔn)備附加下一個新的堿基。 Step2：活化?；罨碌膲A基，準(zhǔn)備和前一個堿基進(jìn)行反應(yīng)。 Step3：耦聯(lián)。第二個堿基附加反應(yīng)到第一個堿基上。 Step4：加帽。把第一個堿即沒有和第二個堿基反應(yīng)上的部分（反應(yīng)失敗部分）加帽封死，不讓其進(jìn)行進(jìn)一步延伸反應(yīng)。 Step5：氧化。對第二個堿基和第一個堿基的連接部分進(jìn)行氧化反應(yīng)，使3價磷變成5價磷，使合成產(chǎn)物變得更加穩(wěn)定。 Step6：循環(huán)往復(fù)

46、至合成完成，然后從CPG上用氨水切離合成好的oDNA。,,,Nucleic Acid Synthesizer,Commercial Nucleic Acid Synthesizer, Model ABI394,CPG (Controlled Pore Glass ) column,Figure 2. DNA Phosphoramidite Monomers, CLICK on image to view a larger image.,Figure 3. Solid Phase Oligonucleotide Synthesis Cycle, Phosphoramidite Chemistry

47、,Figure 4. Structure of a DNA oligo (final product),,Nucleoside Attachment to Controlled Pore Glass,LIGHT INDUCED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS,Solid synthesis Phosphoramidite chemistry CPG solid support Light induced oligonucleotide synthesis Surface hindrance issue and solution Purification and analys

48、is Application,Phosphoramidite monomers,,,DMT: dimethyltrityl,Solid synthesis of oligonucleotide,Standard -Cyanoethyl phosphoramidite DNA synthesis chemistry,Phosphoramidite DNA synthesis Cycle,Heterocyclic Base Protecting Groups,Structure of DNA oligomer,,純化,OPC純化 OPC純化是使用一種反向?qū)游鲋?根據(jù)DNA保護(hù)基(DMTr基)和層析

49、柱中樹脂間的親和力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于90%，適用于PCR用引物，DNA測序用引物，各種探針等。此級別對短鏈較為有效。 PAGE純化 PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的純度大于95%，對長鏈Oligo DNA的純化特別有效。適用于PCR用引物，DNA測需用引物，各種探針等。 HPLC純化,PAGE Purification of Oligonucleotides,,HPLC Purification of Fluorescently

50、 Labeled Oligonucleotide,,Surface of CPG and microfluidic chip,,model pore material,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,planar,concave,convex,,Electron micrograph,,Steric hindrance?----Size,shape/statical SH flow state/dynamic SH Flow state?-----laminar / turbulent Surface property?----processing ,compositi

51、on,glass,CPG pore,CPG pore---5002000 angstrom chamber ----200m70 m,Surface issue of solid synthesis,----Wetting ability Chose linker ----Steric hindrance affect the first several synthesis yield Linker arm ----Flow uniformity Chip design,Wetting ability,Effect of linker length on wetting ability of

52、modified glass surface CH3(CH2)nSiCl3,Steric hindrance,,electrophoresis gel profile of 5-32P-labeled T14 sequences . Lane 1, synthetic failure and capped sequences. Lane 2, Subtraction of the bands of lane 1 from those of lane 2 gives the sequences which coupled with a DMT monomer in the last coupli

53、ng step. Lane 3, sequences synthesized on CPG,Different oligonucleotide length distribution based on amide linker,Linker,,,,,,,,,,,,,,,,spacer,linker,oligomer,Linker arm,,,,,,,,,,hydrophilic ether flexural,Hydrophobic C8,C22 alkyl coiled,,,,,Linker arm structure,Spacer----When we need it?,gelest SIM

54、6492.7,,,,,,Monomolecular layer,Extreme dilute,a,b,c,Suitable density Between a and b,,,,,,,,,,,,,,,3. 基因芯片的應(yīng)用,與英特爾公司制造微處理器的模板類似，美Affymetrix公司研制出了基因分析芯片。Affymetrix公司制造基因分析芯片的技術(shù)與制造微處理器的技術(shù)一樣,都是采用照相平版印刷技術(shù)。 起初，公司指甲大小的原型芯片每塊有兩千種DNA探針。 2005年它的人類6000型芯片有65000種DNA探針。 最新與美惠普公司聯(lián)合研制的系統(tǒng)中的基因分析芯片具有40萬種DNA探針。從理論上講

55、,只要有10個這樣的芯片就可以對一個人的全部基因進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)功能失常的基因。芯片上的DNA探針的數(shù)目越多,所能包含的每種基因的各種化學(xué)變異體的可能性越大。Affymetrix公司的芯片采用定制的加工藝制造,易于批量生產(chǎn)。只要知道了一種基因的基本結(jié)構(gòu),它就可以給計算機化的加工設(shè)備編制程序,制造出可以從任何人的細(xì)胞中挑選出該基因的DNA探針。,美國部分公司基因分析芯片的研究進(jìn)程,人類的癌癥約有60%是由P53的基因功能失常引起。Affymetrix公司正在與Oncor Med公司(一家位于馬里蘭州蓋瑟斯堡的從事遺傳試驗的腫瘤醫(yī)藥公司)聯(lián)合研制一種檢P53基因功能失常的芯片,芯片上密密麻麻排列著大

56、約64000個小方格,每個小方格邊長是人頭發(fā)粗的一半,包含有成千上萬種DNA探針。 Affymetrix公司最近與Dr.Collins進(jìn)行乳腺癌研究,他們用定做的基因分析芯片對病人的細(xì)胞進(jìn)行分析,以發(fā)現(xiàn)腫瘤中的BRCAI基因中的15種不同的變異體。試驗中基因分析芯片在15種中已認(rèn)出了14種。 由Affymetrix公司推出的第一個商用基因分析芯片,能發(fā)現(xiàn)艾滋病毒中可能產(chǎn)生抗藥性的基因變異體。該芯片正在20個醫(yī)療中心試用。掃描和解釋芯片光點的系統(tǒng)售價12萬美元。使用Affymetrix公司具有135000種DNA探針的芯片,破譯人的DNA比廣泛使用的基因順序分析機器快大約25倍。,至少有6家公司

57、想成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的英特爾。如加利福尼亞州森尼維爾的Hyseq公司,聲稱擁有最快的基因分析器,它們由機器人制造,機器人把DNA探針滴到過濾紙上,其DNA陣具有優(yōu)勢,破譯DNA的速度最快。 帕洛阿爾托的 Syntenl公司把細(xì)胞的DNA片搽到邊長為半英寸的玻璃方格上,聲稱它的芯片衡量細(xì)胞中基因活動最有效。 Syntenl公司在近一年多一點時間內(nèi)簽訂了20項研究協(xié)議,其中包括與Merck、SminthKline-Beecham、SminthKline-Beecham、Hoffmann-La Roche等公司。Syntenl公司正在利用基因分析芯片研究前列腺癌等疾病。 圣迭戈的Nanogen公司準(zhǔn)備

58、立即進(jìn)入診斷艾滋病毒和其它傳染病的市場。Incyte制藥公司利用計算機從基因中挑出數(shù)以千計用于治療的微生物,與Affymetrix公司合作生產(chǎn)針對各種疾病的基因分析芯片供藥品研究使用。Incyte制藥公司采用噴墨打印機技術(shù)把DNA探針噴到芯片上。,博奧公司是國家有關(guān)部門批準(zhǔn)的第一家以公司方式注冊運營的國家工程研究中心。到目前，計劃對國內(nèi)相關(guān)科研院所及企業(yè)的生物芯片研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化投入，達(dá)到億元。博奧在國內(nèi)生物芯片產(chǎn)業(yè)中被公認(rèn)為是最好的企業(yè)之一。注冊資本達(dá)3.46億元，但據(jù)透露，目前“博奧”每年仍有些虧損。公司成立年來已申請國內(nèi)外專利項，其中項獲得美國專利授權(quán)，產(chǎn)品與服務(wù)超過項，并將項生物芯片技術(shù)出

59、口到美國。 目前我國生物芯片企業(yè)不少于50家，但獲得SDA認(rèn)證的只有兩家。目前，7080的生物芯片還只是用在研發(fā)上，離完全商業(yè)化還有一段不短的距離。由于研發(fā)成本高，其產(chǎn)品價格也較高。即使目前在此領(lǐng)域最具實力的美國Affymetrix公司，產(chǎn)品單價也高達(dá)上千美元。 中微 天津. 聯(lián)川.,國內(nèi)研究、生產(chǎn)近況,除了以上談到的基因芯片作為檢測芯片檢測細(xì)菌、病毒外，基因芯片還可以應(yīng)用于研究DNA-Protein 相互作用以及研究DNA-藥物相互作用，應(yīng)用于高通量藥物篩選，用于病理、藥理研究，也可用于PCR、LCR檢測等。 蛋白質(zhì)芯片作為檢測芯片以檢測抗體抗原的作用，也可以用于高通量藥物篩選，用于研究DN

60、A-Protein 相互作用、Protein -藥物相互作用以及Protein 金屬相互作用。 微流體芯片在分離分析方面也有廣泛應(yīng)用，每個月都有近百篇論文發(fā)表。,分析芯片,微流體生物芯片還可作為反應(yīng)芯片，用組合化學(xué)高通量篩選、優(yōu)化反應(yīng)條件； 也可用于單純的PCR、LCR反應(yīng)等。,反應(yīng)芯片,Minimizing the surface effect of PDMSglass microchip on polymerase chain reaction by dynamic polymer passivation Yong-Mei Xia,1,2 Zhi-Shan Hua,2 Onnop Sriv

61、annavit,2 Ayse Bilge Ozel2 and Erdogan Gulari2 Journal of Chemical Technology and Biotechnology J Chem Technol Biotechnol 82:3338 (2007),微流體生物芯片可以用硅片、玻璃或PDMS等材質(zhì)制備，關(guān)鍵是對其制備工藝要求很高。UM的芯片制備在電子系的超凈實驗室里進(jìn)行，每人每月的通行證就需支付$1500。目前每塊這種芯片對美國國內(nèi)學(xué)術(shù)單位的售價是$300，對企業(yè)的售價是$700。 GenePix芯片掃描儀對美國國內(nèi)學(xué)術(shù)單位的售價是$75,000。 每套酶切、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、

62、熒光標(biāo)記加上其他輔助試劑等用于DNA探針制備和標(biāo)記的試劑對美國國內(nèi)學(xué)術(shù)單位的售價約為$300-700。,Affordable?,Maybe!,-----------寡核酸芯片用于水體微生物檢測 （全國有多少水域啊?。。。?-----------寡核酸芯片用于中藥活性成分抗腫瘤研究 -----------寡核酸芯片用于腫瘤檢測 -----------寡核酸芯片用于研究DNA-多糖的相互作用 -----------寡肽芯片用于檢測抗體抗原的作用 -----------寡肽芯片用于高通量藥物篩選 -----------寡肽芯片用于研究DNA-Protein 相互作用 -----------寡肽芯片用

63、于研究Protein -藥物相互作用 -----------寡肽芯片用于研究Protein 金屬相互作用 -----------糖芯片。。。。。。。?。?！,我校在此領(lǐng)域可能的切入點,,Wow, could be your dissertation ！！!,Case 1,,,NSFC 20875038 用微流控miRNA-mRNA 芯片研究發(fā)酵靈芝多糖的肝癌抑制作用 資助經(jīng)費： 36.00 萬元 執(zhí)行年限：2009.01-2011.12 負(fù) 責(zé) 人：夏詠梅,miRNA 及其與癌癥關(guān)系的發(fā)現(xiàn)是目前基因檢測中最引人注目的課題之一，而中藥藥理的研究受限于傳統(tǒng)的低通量檢測方法。 本課題將制備并應(yīng)用微流控

64、miRNA-mRNA 芯片研究發(fā)酵靈芝多糖對肝癌的抑制作用。 將采用數(shù)字掩膜光引發(fā)原位合成策略，基于雜交實驗的反饋，通過優(yōu)化miRNA 和mRNA 探針分子設(shè)計、芯片表面衍生化設(shè)計與衍生化探針合成，制備高特異性的光引發(fā)原位合成微流控miRNAmRNA芯片，提高其靈敏度和特異性； 通過對檢測條件的調(diào)控，研究發(fā)酵靈芝多糖對腫瘤細(xì)胞處理產(chǎn)生的miRNA 和mRNA 表達(dá)差異，以及體內(nèi)外實驗的表達(dá)譜差異，研究其作用條件和作用結(jié)果的時間譜； 通過對實驗結(jié)果的生物統(tǒng)計學(xué)分析，對其肝癌抑制過程進(jìn)行研究。 本課題的研究將給微流控基因芯片的制備和中藥分子藥理的研究提供思想、方法和技術(shù)上的參考，將有助于加深對傳統(tǒng)

65、中藥靈芝的藥理理解。,技術(shù)路線,MicroRNA Array Service,total RNA + Chip Request,Small RNA Extraction,Label Small RNAs,Hybridization,Staining Chip,Stringency Wash,Scan,Data Analysis,Standard Data Analysis,In-depth Data Analysis Optional,cell,QC,QC,QC,Chip Synthesis,QC,P,P,P,NP,NP,NP,miRNA microarray containing known

66、 miRNAs and predicted non-coding small RNAs,Distinct microarray profiles of adult mouse tissue samples vs embryonic stem cells,Adult mouse tissue,Embryonic stem cell,Cy3: Adult mouse tissue Cy5:GCNF knockout of the mouse embryonic stem cell,Cy3: Adult mouse tissue Cy5: Embryonic stem cell,樣品標(biāo)記路線,實驗步驟,樣品處理的總RNA樣品提取 分別提取mRNA 與mi RNA mRNA進(jìn)行片段化處理 片段化處理后的樣品與mi RNA 進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng) 探針設(shè)計 芯片合成 芯片雜交 數(shù)據(jù)提取與處理,Boring? Im running for bus..,The End,,,,,,,,,,,,,,,,,