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1、生物芯片技術及其進展 侯治富 吉林大學白求恩醫(yī)學部 中日聯(lián)誼醫(yī)院 生物芯片技術的主要內(nèi)容 生物芯片的概念 生物芯片的基本原理 生物芯片的分類 生物芯片的發(fā)展歷程 生物芯片的技術方法 生物芯片的應用 生物芯片的定義 生物芯片 （ Biochip或 Bioarray） 是指包 被在固相載體上的高密度 DNA、 抗原 、 抗 體 、 細胞或組織的 微點陣 (microarray） 。 生物芯片的種類：包括 DNA芯片、抗原芯 片、抗體芯片、細胞芯片、組織芯片等。 1998年世界十大科技突破之一。 未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。 生物芯片的定義
2、 Bio： 詞素 生 ...， 生物 ...; Chip： 屑晶片 , 薄片 ; 電子 集成電路片 ; 英漢計算機名詞 芯片 Array： 陣 ,列 ,排列 ,配置 ,系 ,組 ,級數(shù) ,芯片 生物芯片的概念 集成 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Oncogene Targets On the AmpliOnc I Biochip PDGFB EGFR1 PDGFRA MET FGFR2 WNT1 MYB HER2 YES1 HRAS1 CND1 RAF1 GLI MYC MDM2
3、20q13 REL MYCL1 FGR FES ABL INT2 PIK3CA NMYC AKT2 FGFR1 JUNB AKT1 KRAS2 CDK4 AR 生物芯片基本原理 生物芯片的特點 高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖 譜的快速對照和閱讀。 多樣性：可進行樣品的多方面分析，提高 精確性，減少誤差。 微型化 ：減少試劑用量和反應液體積，提 高樣品濃度和反應速率。 自動化 ：降低成本，保證質量。 高通量 生物芯片的分類 尚未統(tǒng)一 。 廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片 固化材料：基因芯片、蛋白質芯片、 細胞芯片、組織芯片 用途分類 生物芯片研
4、究的歷史 1991 Affymatrix公司 Stephen Fodor:光刻與光化 學技術、 多肽和寡聚核苷酸微陣列。 DNA Chip概念 Stanford大學 Brown實驗室：預先合成 ， 機械手陣列 1995 Schena等 ：基因表達譜 1996 Chee et al： DNA測序 1996 Cronin et al： 突變檢測 1996 Sapolsley & Lipshutz： 基因圖克隆 1996 Shalon et al： 復雜 DNA樣本分析 1996 Shoemaker et al： 缺省突變定量表型分析 分類（根據(jù)應用）
5、 基因變異檢測芯片 疾病檢測 (如 HIV、 P53基因、結核桿菌 ) 法醫(yī)鑒定 (如 DNA指紋圖譜 ) 表達譜芯片 腫瘤相關基因 (正常與腫瘤組織表達差異 ) 藥物篩選 (培養(yǎng)細胞藥物刺激前后表達差異 ) 發(fā)育 (同一組織不同發(fā)育時期基因表達差異 ) 組織發(fā)生 (不同組織或器官的基因表達差異 ) 分類（根據(jù)工藝和載體） 原位合成法： 密集程度高，可合成任意序 列的寡聚核苷酸，但特異性較差，寡聚核苷 酸合成長度有限，且隨長度增加，合成錯誤 率增高。成本較高，設計和制造較煩瑣費時。 DNA微矩陣法 ： 成本低，易操作，點樣密度 通常能滿足需要。芯片的載體需表面緊質、
6、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等， DNA微矩陣 芯片常用玻片為載體。 D N A C h i p s Pr o te i n C h i p s L a b C h i p s B i o c h i p s 分類（根據(jù) DNA成分） 寡聚核苷酸或 DNA片段：約 2025個核 苷酸堿基，常用于基因類型的分析， 如突變、正常變異（多態(tài)性）。 全部或部分 cDNA： 約 5005000個核苷 酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的 相關基因表達分析。 Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based a
7、ssays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise) Oligo-Chip cDNA-Chip
8、 Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n sequencing expression expression genomic analysis 基因芯片的種類 Science Chip： 生物分析和診斷。 Nutri Chip： 食物分析、轉基因、污染檢測。 Leuko Chip： 血液分析、病毒分析、 HLA分析。 Aqua Chip： 水質分析。 Secure Chip： 含 DNA的物質鑒定。 Chromo Chip： 基因分析和染色體序列。 Prokaryo Chip： 原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等。 生物芯片技術
9、主要環(huán)節(jié) 芯片制備：微點陣 樣本制備： DNA提純、擴增、標記 雜交：樣本與互補模板形成雙鏈 檢測：共聚焦掃描，雙色激光 數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索， RNA印跡等。 結果分析 細胞 對 mRNA進行標記 雜交 基因表達資料 生物芯片的制作步驟 生物芯片分析 1、測定過程應包括五個 基本步驟： 需解決的生物學問題 樣本制備 生物化學反應 檢測 數(shù)據(jù)分析 Tumor Sample Normal Sample 2、生物學系統(tǒng)控制必須精確地與檢測目的相匹配。 3、生物學樣本必須精確地與生物學種類相匹配。 4、所有基因
10、分析必須平行處理。 5、基因分析技術必須適合微型化和自動化。 6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學樣本的次序。 7、檢測系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。 8、檢測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復。 9、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應受到單 個實驗所固有特性的限制。 10、絕對比例關系只存在于組合實驗的平 行數(shù)據(jù)組內(nèi)。 11、平行格式包括內(nèi)在和外部的整個系統(tǒng) 誤差的分析因素。 12、在每個系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有 變量的四維數(shù)據(jù)時，才能稱為完成生 物系統(tǒng)平行基因分析。 生物芯片技術的 12條原則只是一個基本 框架。其術語的詳細定義和有關理論可 參見 h
11、ttp://cmgm.stanford.edu/schena/ 芯片制備 原位合成法（ in situ synthesis):又 可分為 原位光控合成法和原位標準試劑合成法。適用 于寡核苷酸，使用光引導化學原位合成技術。 是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。 合成后交聯(lián)（ post-synthetic attachment): 利用 手工或自動點樣裝置將預先制備好的寡核 苷酸或 cDNA樣品點在經(jīng)特殊處理過的玻片或其 他材料上。主要用于診斷、檢測病原體及其他 特殊要求的中、低密度芯片的制備。 兩種制備方法比較 原位合成： 測序、查明點突變 高密度、根據(jù)已知的 DNA編制程
12、序 制作復雜、價格昂貴、不能測定未知 DNA序列 合成后交聯(lián)： 比較分析 制備方式直接和簡單，點樣的樣品可事先純化， 交聯(lián)方式多樣，可設計和制備符合自己需要的芯片。 中、低密度，樣品浪費較多且制備前需儲存大量樣品。 雜交 是芯片技術中除方陣構建外最重要的一步 液相中探針與 DNA片段按堿基配對規(guī)則形成 雙鏈反應。 選擇雜交條件時，必須滿足檢測時的靈敏 度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能 保證每條探針都能與互補模板雜交。 合適長度的 DNA有利于與探針雜交。 溫度、非特異性本底等均會影響雜交結果。 最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。 樣本制備 制備
13、高質量樣本是困難的但又是極其重要的。 制備細胞、組織或整個器官樣本應特別小心。 溫度、激素和營養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分 等輕微改變都會使基因表達的結果發(fā)生明顯變 化。 用于基因類型分析的樣本是 DNA， 用于表達研 究的樣本是 cDNA。 樣本制備后應進行標記，通常為酶標記、熒光 標記和核素標記。 結果分析 芯片與標記的靶 DNA或 RNA雜交后，或與標記的 靶抗原或抗體結合后，可采用下列方法分析處 理數(shù)據(jù)： 共聚焦掃描儀：應用最廣，重復性好但靈敏度 較低。 質譜法：快速、精確，可準確判斷是否存在基 因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針 合成較復雜。 化學發(fā)光、
14、光導纖維、二極管方陣檢測、直接 電荷變化檢測等。 芯片掃讀裝置 根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍 增管型和 CCD型。 根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光 型。 應用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃 描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好 的定位功能，可定量，應用廣泛。 圖象分析 復雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件 來完成。 分析軟件的功能：鑒定每個點陣、最大 限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏 色圖象、可標記或排除假陽性、識別和 分析對照實驗是否成功、可將信號標準 化等。 圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù) 據(jù)庫的能力。 質量控制 實驗對照： 體外轉錄從 c
15、DNA合成 mRNA， 參入標本中作為對照 。 此 mRNA不與點陣的核酸雜交 。 將不同濃度的不同基因參入標本中 ， 可作為標本 間標準化的參照 。 用兩種不同吸收光譜的熒光素同時分析兩個標本 ， 如果兩種熒光強度一致 ， 可排除標本間變異因素 。 用單一堿基錯配的寡核苷酸做對照可排除交叉雜 交 。 結果有效性的證實 在表達矩陣上，有時難于區(qū)分極其相似的序列，如 基因族成員，亞類或異類的存在。 比較兩種不同 DNA序列表達水平時，有些參數(shù)如核 苷酸的成分、二級結構的存在和矩陣上 DNA的長度 都會影響雜交。 證實矩陣分析的結果可用 RT-PCR(區(qū)別基因族成員 ,
16、 比較不同 DNA種系表達 ,證實基因變異或突變和精確 測定 DNA表達水平 )、 Northern Blot(證實某一基因 的相對表達水平 )、 Western Blot(RNA表達是否達 到細胞中的蛋白水平 )、質譜儀 (證實矩陣結果是否 在蛋白水平 )等。 生物芯片技術的應用 基因表達分析：腫瘤 基因突變檢測：遺傳性疾病 測序、基因圖繪制和多態(tài)性分析：測序 微生物菌種鑒定：毒力基因、抗藥基因 藥物研究：新藥篩選、指導合理用藥 克隆選擇及文庫篩選 生物芯片技術的發(fā)展 發(fā)展趨勢 微型化： DNA矩陣越來越小。 集成化：矩陣上的基因組越來越大 。 多
17、樣化：測定范圍越來越廣。 微量化：測定所需樣本越來越少。 全自動化：樣品制備到結果顯示全部分析過程。 定量化： 如激光捕獲技術，顯微解剖技術等可 精確測定一個細胞內(nèi)的一個基因的表達。 DNA矩陣數(shù)據(jù)信息庫的完善。 生物芯片技術的發(fā)展 技術 毛細管電泳芯片技術 PCR芯片技術 (PCR-Chip) 縮微芯片實驗室 (lab-on-a-chip) 微珠芯片技術 (beadArray) 抗體和蛋白質陣列技術 (Antibody and protein-array technology) 自我定制芯片技術（ make your own chip) 血氣分析芯片
18、 毛細管電泳芯片技術 Mathies最早報道毛細管電泳芯片測序結果， 在 10分鐘內(nèi)完成了對 433個堿基序列的測定。 賓夕法尼亞大學 Wilding等成功地利用毛細管 電泳芯片分離了用于診斷杜鑫 -貝克肌萎縮的 多條 DNA片段。 瑞士 Ciba-Geigy公司和加拿大 Alberta大學合 作利用玻璃毛細管電泳芯片完成了對寡核苷酸 的分離。 縮微芯片實驗室 在一張芯片上完成樣品 (如血液、組織等 )制備、 化學反應、檢測和數(shù)據(jù)分析。 1998年程京博士首次應用 LOC實現(xiàn)了從樣品制備到 反應結果顯示的全部過程，成果地從混有大腸桿 菌的血清中分離出了細菌。 含有加熱
19、器、微泵微閥、微流量控制器、電子化 學和電子發(fā)光探測器的芯片已經(jīng)問世。也已出現(xiàn) 樣品制備、化學反應和分析檢測部分結合的芯片。 LOC與衛(wèi)星傳輸和網(wǎng)絡生物信息學結合，將實現(xiàn)高 通量、一體化和移動性的 “ 未來型掌上實驗室 ” 的構想。 抗體和蛋白質陣列技術 蛋白質組學 (protiomics)的興起，促 進了抗體和蛋白質陣列技術的發(fā)展。 Pareick Brown使用特異性抗體微矩陣， 測定了細胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋 白質。 Leuking等采用蛋白質微陣列技術，測定 了 10pg的微量蛋白質，并證實假陽性極低。 乳腺癌基因芯片 Stanford 乳腺癌微矩陣 (P
20、erou et al.1999) 每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個實驗用 列表示。 顏色強度表示對照和實驗 cDNA的比率。 比率相同時為 1。 結果為紅色表示 mRNA增加，綠色表示減 少，灰白色表示缺乏。 兩種基因的相似性用 Pearson相關公式或 Euclidian測距公式計算。 DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達 Kavine Maillard et al(1999) cDNAs進行 DNA表達矩陣， PCR產(chǎn)物包 被在經(jīng)賴氨酸處理的玻片上，用 Cys3-和 Cys5-標記的 cDNA進行雜交， 洗滌后用 Scanarray3000掃描儀測定 矩陣，表達數(shù)據(jù)儲存在 ACeD
21、B數(shù)據(jù)庫 中，根據(jù)數(shù)據(jù)表達類型區(qū)分不同的 基因。 微矩陣分析 DNA和蛋白表達 Holger Eickhoff et al.(1999) 根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合 800000人類 EST序 列，已重矩陣了 38000克隆用于 RNA表達分析， 克隆經(jīng) PCR擴增后共價結合于玻片上，每張玻 片固定 19200個基因片段，標記人組織 RNAs與 被選的 38000人基因片段的矩陣進行雜交，比 較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點識別 和點定量。 使用寡聚核苷酸鑒定新的 cDNA克隆，和進入表 達載體，使相應蛋白能直接表達，矩陣后可分 析蛋白 -蛋白和蛋白 -DNA的關系。 生物芯片相
22、關儀器 點陣儀：制備芯片。點樣針分為實心和 空心兩種，點樣方式有非接觸噴點和接 觸點樣兩種。 雜交儀：全自動完成調(diào)節(jié)、加探針、漂 洗和熱循環(huán)的雜交過程。 掃描儀：激光共聚焦或 CCD直接成像分析 結果。 Q Bot 超高解析基因篩選暨排列分析儀。 基因菌落篩選 (Colony Picking)： 3500/h 基因排列打點 (Gridding)： 100000/h 基因復制 (Replication)： 9696,96384 基因重新排列 (Re-Arraying)： 正確的基因置復制 盤 基因微矩陣排列 (Micro-Arraying)： 20000/片
23、 全自動液體分注系統(tǒng) (Liquid Handling):96針， 注液量 1200l， 適合 PCR產(chǎn)物。 分析軟件：分析、質控、上網(wǎng)。 環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁 板 Q Pix 半敞開式基因篩選暨排列分析儀 (經(jīng)濟型 ) 基因菌落篩選 (Colony Picking)： 3500/h 基因排列打點 (Gridding)： 100000/h 基因復制 (Replication)： 9696,96384 基因重新排列 (Re-Arraying)： 正確的基因置復制 盤 基因微矩陣排列 (Micro-Arraying)： 20000/片 分析軟件：分
24、析、質控、上網(wǎng) 環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板 Q Array 第三代半敞開式基因微矩陣排列儀。 基因微矩陣排列 (Microarrying)： 同時處 理 84片玻片，每一打點玻片分 4個區(qū)域，可 安排不同的矩陣排列。可選 16或 24針座。 儀器容量：玻片 84片，玻片架 6個， 384孔 板 5盤。 分析軟件：分析、質控、上網(wǎng)。 環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極 處理鋁板。 自動液體處理系統(tǒng)。 雜交儀 Affymetrix 640雜交 儀： 溫度范圍： 0100C 探針用量： l 流速： 10ml/min 樣本區(qū)： 2.46.4cm 掃描儀 GenearrayTM掃描儀： 激光：氬離子 ,488nm 適用染料：熒光素、 藻紅素 單掃描時間： <4分鐘 分辨率： 3、 6、 9或 24微米 Summary(1) 流 程 系 統(tǒng) 組織芯片 組織芯片 點樣儀 石蠟包埋機 組織脫水機 細胞芯片 微流控系統(tǒng)
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