細(xì)胞生物學(xué)之細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的分子機(jī)制

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1、細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的分子機(jī)制 細(xì)胞凋亡的基本概念 : 細(xì)胞凋亡 （ apoptosis)(有樹葉凋零之意 ) 或 程序化細(xì)胞死亡 （ programmed cell death , PCD) 是指多細(xì)胞有機(jī)體在正常生理或病理情 況下，發(fā)生的一種由多基因控制的主動死亡 過程。 第一節(jié) 凋亡細(xì)胞的特征及生物學(xué)意義 (一 ) 細(xì)胞凋亡的組織學(xué)變化 只發(fā)生在單個或幾個細(xì)胞，其緊鄰細(xì)胞完好； 與緊鄰細(xì)胞間有空隙，有離群、脫落感；不引起 炎癥反應(yīng) (二 ) 主要形態(tài)學(xué)特征 (多階段 ) 凋亡細(xì)胞其形態(tài)特征表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變小； 核固縮，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞急劇變??； 細(xì)胞骨架解體，最后變成若干個凋亡小體。 注意點

2、： 凋亡全過程，質(zhì)膜仍保持完整，細(xì)胞內(nèi)容 物不釋放，不引起炎癥反應(yīng)。 一、細(xì)胞凋亡的基本特征 1. 細(xì)胞核的變化 核內(nèi)染色質(zhì)凝聚、形成染色質(zhì)塊，并聚集于核的邊 緣呈多種形狀排列，然后逐步分裂為碎片（核碎片 形成）。 2. 細(xì)胞質(zhì)的變化 (1) 胞質(zhì)脫水濃縮，體積減少約 30% (2 ) 細(xì)胞器的變化 : A.線粒體早期體積增大，嵴增多 晚期成空泡狀 , B失去微絨毛、細(xì)胞突起及細(xì)胞表 面皺褶，膜電位下降，膜 流動性下降； C. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 腔擴(kuò)大； D. 細(xì)胞骨架變得致密和紊亂。 3. 凋亡小體的形成 * 凋亡小體的概念 指凋亡的最后階段，由胞質(zhì)分割形成大小不等， 含有細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞器及核碎片的膜

3、包被小體。 * 形成機(jī)制 （ 1）細(xì)胞表面突起形成 -包裹膜融合、根部縮 窄 脫落 （ 2）胞內(nèi)自噬體形成 -向胞外釋放 應(yīng)指出！有時凋亡細(xì)胞膜不分割，僅發(fā)生核固縮和 胞質(zhì)高度濃縮成單個致密結(jié)構(gòu)亦稱凋亡小體。 凋亡時細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 空泡化 固縮 出芽 邊集 凋亡小體 (二 ) 細(xì)胞凋亡的生化特征 1. DNA片段化（主） 凋亡細(xì)胞 DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈特征性 梯狀條帶圖譜（ Ladder）。 機(jī)制： 核小體中的組蛋白與 DNA的連結(jié)鍵斷 裂，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，有控制的特 異地將 DNA降解為 180200bp整數(shù)倍大小 的若干條帶。 DNA Fragmentation Nucleo

4、somal Banding Pattern 3. 其它生化改變 1) 胞漿 Ca2+水平 與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切，實驗證明，凋亡的發(fā)生伴 隨胞漿 Ca的升高。 2) 胞漿 H離子濃度 細(xì)胞凋亡伴隨胞漿 PH下降。 3) 線粒體 凋亡時，呼吸鏈?zhǔn)軗p， ATP合成下降，膜電位下降 (m) ；膜通透性增加。 4) 細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻 膜磷脂的不對稱性分布改變 , 凋亡時 PS由質(zhì)膜內(nèi) 側(cè)翻向外側(cè) . （二）細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 -1 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死 誘導(dǎo)因素 細(xì)胞數(shù)量 膜完整性 染色質(zhì) 細(xì)胞核 細(xì)胞器 胞內(nèi)容物 生理性、弱刺激性 單個細(xì)胞丟失 保持至晚 凝聚呈半月狀 早期固縮、斷裂 無明顯變化

5、 無釋放 強烈刺激 成群細(xì)胞死亡 早期即喪失 稀疏呈網(wǎng)狀 晚期破碎 腫脹、破壞 釋放 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死 細(xì)胞形狀 基因組 DNA 大分子合成 基因調(diào)控 后果 意義 形成凋亡小體 受調(diào)控降解 一般需要 有 不引起炎癥反應(yīng) 生理性死亡 破裂成碎片 隨機(jī)降解 不需要 無 引起炎癥反應(yīng) 病理性死亡 細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 -2 二、細(xì)胞凋亡的廣泛性及其意義 作為一種生理性細(xì)胞消亡方式，普遍存 在生物界；例如： 1 高等脊椎動物胚胎發(fā)育中某些細(xì)胞的丟失 ; 2 兩棲類動物變態(tài)過程中幼體器官的退化 ; 3 成熟個體中亦有細(xì)胞凋亡發(fā)生，如：血細(xì)胞、上皮 細(xì)胞、肝細(xì)胞等以正常細(xì)胞更新衰老細(xì)胞過程； 4 通過凋

6、亡清除受損傷或癌前病變的細(xì)胞 ,防止癌變 ; 5 病毒、藥物、毒物等均能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義 其一 : 具有清除個體發(fā)育過程及成熟個體中多 余細(xì)胞及老化細(xì)胞的機(jī)體調(diào)節(jié)作用 其二 : 具有消除對機(jī)體有害的癌變細(xì)胞及病毒 感染細(xì)胞的機(jī)體防御作用 因此， 細(xì)胞凋亡是維持個體生存所必需的 一種生物學(xué)機(jī)制 細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制 一、細(xì)胞凋亡的酶學(xué)基礎(chǔ) 細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白酶和核酸酶的活化是凋 亡過程的核心事件。 有人甚至認(rèn)為細(xì)胞凋亡過程就是蛋白酶級 聯(lián)反應(yīng)的過程。 （一） caspase家族與細(xì)胞凋亡 Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶 (Cysteinyl aspartate-sp

7、ecific protease); 是一類與白介素 -1 轉(zhuǎn)化酶和線蟲凋亡基因 Ced (ICE/Ced)同源的一類半胱氨酸蛋白酶 ; 活性位點含有保守的 aa序列 (QACXG, X為 R,Q或 G); 以無活性的酶原形式合成并存在于細(xì)胞中； 可以被上游 Caspase或自身切割保守的 ASP 活化； 1. Caspase的性質(zhì)和種類 已在哺乳類中發(fā)現(xiàn) 14種，分為 3個亞類： Caspase-1亞家族， Caspase-2亞家族， Caspase-3亞家族 亦可根據(jù)前體分子 (procaspase)N端的原結(jié) 構(gòu)域 (prodomain)分為 2類 : 具” Long-prodomain”

8、的啟始分子 (initiator), 如 -8、 -9、 -10等，為蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的啟始者， 其活化后再切割和活化下游 Caspase； 具” short-prodomain”的效應(yīng)分子 (effector), 如 -3、 -6、 -7等，作為上游酶的底物被切割活化， 再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細(xì)胞凋亡。 2. Caspase的結(jié)構(gòu)特點和活化機(jī)制 原結(jié)構(gòu)域 大亞基 小亞基 N端 D28 QACRG D175 IETD Caspase 異二聚體化 異四聚體化 蛋白酶活性 3. Caspase活化的級聯(lián)反應(yīng)過程 多種凋亡因素，通過多種途徑活化 Caspase; 凋亡時 起始 Caspase首先

9、被活化 ,其后又切割 并活化下游 Caspase,級聯(lián)放大 ,直至 效應(yīng) Caspase被活化； 細(xì)胞中的 Caspase一旦被活化 ,凋亡即不可避 免 ; 4. 效應(yīng) caspase引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制 已發(fā)現(xiàn)的 caspase底物上百種 , 僅少數(shù)底物與凋 亡的關(guān)系被確認(rèn) ; 滅活細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白 非凋亡細(xì)胞中 , CDA (caspase活化的 DNAase)與其抑制 蛋白 (ICDA)結(jié)合 ; 凋亡細(xì)胞中 , caspase剪切 ICDA; CDA游離并進(jìn)入核內(nèi)降解 DNA,細(xì)胞凋亡 . 剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白 如 Caspase對核板的降解作用 ; 在凋亡過程中 , caspase在單一位

10、點剪切核纖層蛋白 (lamin), 導(dǎo)致核板塌陷 , 染色質(zhì)濃縮 . 剪切效應(yīng)蛋白 : 如參與基因表達(dá)蛋白因子 ,如 PARP 活化 caspase抑制劑 (二 ) 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其他酶類 核酸內(nèi)切酶 (endonuclease) 主要是 DNase, 包括 DNase 、 DNase 、 NUC18等； 大多數(shù) DNase在細(xì)胞凋亡時作為 caspase的底物被活化 并發(fā)揮作用，如 CAD等； 其作用點是核小體的連接處切割 DNA，產(chǎn)生 180200bp 的 Ladder. 蛋白激酶 (protein kinase， PK) PKC可通過 caspase相互作用影響細(xì)胞凋亡； DNA-PK（

11、 DNA依賴性蛋白激酶），活化后參與 DNA損 傷與修復(fù)，能抑制凋亡， 能被 caspase-3滅活。 其他酶類： 絲氨酸蛋白酶（如粒酶 B）、 calpain、 NOS等 二、細(xì)胞凋亡的信號傳遞途徑 細(xì)胞凋亡的影響信號分為 2類： 一類為凋亡的負(fù)調(diào)控信號（抑制凋亡）； 另類為凋亡的正調(diào)控信號（誘導(dǎo)凋亡） 細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特點： 同一性： 各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改 變均相同。 多樣性： 環(huán)境因素不同，細(xì)胞類型不同，或刺 激因素不同時，從凋亡程序啟動到凋亡發(fā)生， 其信號傳遞途徑是不同的。 分類： 百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成 一條條的信息傳導(dǎo)通路，可分為 基本傳導(dǎo)通路 和非專

12、一性傳導(dǎo)通路二類。 （一）死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 死亡受體 (death receptors,DR)： 指細(xì)胞表面存在的一類能結(jié)合凋亡剌激分子， 并將信號傳遞至胞內(nèi)引起細(xì)胞凋亡的受體。 屬腫瘤壞死因子受體（ TNF）超家族； 包括 16個富 Cys結(jié)構(gòu)域組成的保守的胞外區(qū)， 和一個由 6080aa組成的 “ 死亡結(jié)構(gòu)域 ” (death domain, DD)； DD將受體信號與胞內(nèi)凋亡機(jī)制相偶聯(lián)； 分類： CD95(Fas/Apol), TNFR1,TNFR2, DR3(Apol3/Esl1)等近十種。 死亡結(jié)構(gòu)域 ” 概念： 是凋亡信號受體共有的、存在于胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo) 細(xì)胞凋亡所必需的一段高度

13、同源的 aa序列。 種類： FADD： fas-associated death domain (Fas相關(guān)的 死亡結(jié)構(gòu)域 )； TRADD： TNF recptor-associated death domain (TNF1受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域 )； RIP： receptor interacting protein (受體相互作用 蛋白 )（含相似的死亡域） DD的活化或過表達(dá)都會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 . TNF TNF TNF DD DD DD TNFR1 DD DD 死 亡 誘 導(dǎo) 信 號 復(fù) 合 物 (DISC ) 形 成 DD RIP DD FADD DED 活化 NF-B， AP-1 促

14、進(jìn)炎癥， 免疫反應(yīng)等 活化 Caspase-8 Caspase級聯(lián)放大 細(xì)胞凋亡 TRADD （二）線粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導(dǎo)途徑 線粒體細(xì)胞凋亡過程中既是引發(fā)器，又是信號放大 器； 幾乎所有的誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡都伴隨著線粒體 跨膜電位 (m)的下降 ; m的維持，與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔（ MPT）部 分相關(guān)； 幾乎所有的凋亡誘導(dǎo)因素導(dǎo)致 MPT破壞或開放； 開放的后果是， m 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、 GSH耗竭、 ROS產(chǎn)生等，并形成惡習(xí)性循環(huán)。 MPT的這種自我放大效應(yīng)，很可能是一種細(xì)胞死亡 “ 全或無 ” 的開關(guān)。 線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)分子 在多種誘導(dǎo)因子（如 Bax過表達(dá)、 UV照射）

15、作 用下， MPT開放和 外膜破壞； 線粒體釋放多種凋亡相關(guān)分子，如 CytC、 Smac、 Endo G等 細(xì)胞色素 C： 釋放到胞質(zhì)中的 CytC，可特異性地結(jié)合接頭蛋 白 Apaf并使之寡聚化， Apaf借助 N-端 caspase 相關(guān)征驀結(jié)構(gòu)域 （ CARD） ,直接驀集多個 caspase-9并使之活 - -凋亡。 （三）細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑（略） 細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制之一， 就是通過粒酶 B來實現(xiàn)的。 粒酶 B的特點 粒酶（ cranzyme, Cr）是 CTL和 NK細(xì)胞殺 傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱； 首先酶原形式合成，受刺激后激活； 已發(fā)現(xiàn) 5種： CrA

16、、 B， H、 M和類胰蛋白 酶 -2; 其中以 CrB促凋亡作用最強 ; （三）粒酶 B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 粒酶 B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑 CrB由 CTL分泌進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿后 ,其絲氨酸蛋白 酶在胞漿 pH7.0條件下發(fā)揮最佳活性，切割胞漿 和核中的多種底物； 以此介導(dǎo)的死亡途徑是多層次、多水平的，以便 快速清除異常細(xì)胞 ； Caspase依賴的死亡通路是 CrB介導(dǎo)細(xì)胞死亡的 重要途徑之一： 在體外， pro-Caspase家族中，除 -1外其余的都 可被 CrB切割活化， -10和 -7是 CrB的最適底物； 線粒體介導(dǎo)的死亡途徑是另一個重要的途徑： 需要多種蛋白質(zhì)（如 Bax、 Bid、 B

17、ak）參與，與 線粒體膜通透性及 m 有關(guān)。 死亡受體 (Fas/CD95,TNFR1) CD95配體 ,TNF- FADD Caspase-8,10 Caspase-3,6,7 PARP,Lamin,PK,DNA-PK DNA斷裂 ,細(xì)胞固縮等 細(xì)胞凋亡 Caspase 激活物 起始 Caspase 效應(yīng) Caspase Caspase 底物 CTL 粒酶 B,穿孔素 胞外 CrB 生長因子撤除 , 化學(xué)藥物等 Cyt C Apaf-1 Caspase-9 AIF,endo G 凋亡主要途徑小結(jié) 第三節(jié) 細(xì)胞凋亡的調(diào)控 目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞分裂、分 化類似，受細(xì)胞內(nèi)多種基因的調(diào)控，是

18、一 個級聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。 已發(fā)現(xiàn)許多基因參與細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控， 包括： ced、 bcl-2 、 ICE、 p53、 IAP家族、 Fas/Apo、 c-myc等。 至今調(diào)控機(jī)理尚未十分明了。 P53的結(jié)構(gòu)： p53基因位于人染色體的 17 p13.17，編碼 53kDa的 P53蛋白轉(zhuǎn)錄因子； 野生型 P53蛋白由 393aa組成，活性形式為四 聚體； 自 N端起包括：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、 DNA結(jié)合區(qū)、 四聚體化區(qū)和 C-調(diào)節(jié)區(qū)； C-端的 26aa構(gòu)成一個開放的結(jié)構(gòu)域，易被降 解或磷酸化修飾，受其他蛋白調(diào)節(jié)。 一、細(xì)胞自身蛋白的調(diào)控作用 （一） P53蛋白的調(diào)控作用 P53的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)

19、 正常狀態(tài)下： 胞漿 P53水平很低，半衰期很短， 胞內(nèi) P53被嚴(yán)格監(jiān)控，受 HDM2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)， 并通過泛素降解途徑調(diào)節(jié) P53水平。 異常情況下： 當(dāng)細(xì)胞 DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常 表達(dá)等細(xì)胞生存面臨威脅時； P53水平迅速升高和活化； P53對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用 野生型 P53蛋白： 具維持細(xì)胞生長、抑制惡性增殖的作用； P53蛋白作為 “ 基因警衛(wèi) ” 負(fù)責(zé)維持基因組的完 整性、 DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運轉(zhuǎn)； 如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡 的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。 突變型 P53蛋白： 喪失抑制細(xì)胞惡性增殖功能， p53基因突變

20、是 50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因 ; 并且本身具有癌基因功能。 P53蛋白 基因衛(wèi)士 P53蛋白 解鏈酶 復(fù)制因子 A P21蛋白 細(xì)胞停滯于 G1期 細(xì)胞凋亡 酸性區(qū) 核心區(qū) 堿性區(qū) P53蛋白 DNA損傷 P21基因 P53蛋白 抑 制 P53蛋白 細(xì) 胞 周 期 (二 )Bcl-2基因家族 bcl-2基因 bcl-2基因發(fā)現(xiàn)于 1985年。定位于 18q21 基因長約 230kb（ 2個內(nèi)含子各 3 個外顯子），編碼 23kd膜 鑲嵌蛋白質(zhì)，與 Ced-9有 23%的同源性。 Bcl-2對需要長期生存的細(xì)胞 ,如神經(jīng)細(xì)胞、免疫記 憶細(xì)胞和造血祖細(xì)胞等的壽命有重要意義。 急性淋巴細(xì)胞白

21、血病，急性髓細(xì)胞白血病，慢性粒 細(xì)胞白血病，細(xì)胞膜內(nèi) Bcl-2蛋白質(zhì)增加顯著。 Bcl-2的功能 屬 凋亡抑制基因 ，阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì) 胞壽命，但對細(xì)胞周期和分化無影響 阻止或減少各種刺激引起的細(xì)胞損傷。如 Bcl-2能阻止由 r射線和多種化療藥導(dǎo)致的細(xì) 胞凋亡。 Bcl-2蛋白具抗氧化作用 Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞器內(nèi) Ca2+ 離子向胞質(zhì)釋 放，而凋亡必須有 Ca2+ 離子參與 。 bcl-2家族 家族成員 可能存在的聚合體形式 抑 制 凋 亡 促 進(jìn) 凋 亡 bcl-2 Bcl-2/Bcl-2 Bax/Bcl-2 bcl-xL Bcl-xL/bcl-xL Bcl-2/Bcl-xL b

22、ax Bax/Bax Bax/Bcl-2 bad Bad/Bcl-2 Bad/Bcl-xL bcl-xs Bcl-xs/Bcl-2 Bcl-xs/Bcl-xL Mcl-1 Mcl-1/bcl-xL Mcl-1/Bcl-2 Bcl-2家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制 Bcl-2、 Bax和 Bcl-x組成一個凋亡調(diào)控系統(tǒng) 當(dāng) Bax/Bax同源二聚體形成時，便誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡； 隨 bcl-2表達(dá)量增加，漸多的 Bax/Bax解聚， 形成更穩(wěn)定的 Bax/Bcl-2異源二聚體，從而中 和了 Bax/Bax誘導(dǎo)凋亡的作用。即 Bax和 Bcl-2 比值調(diào)節(jié)凋亡 ； 當(dāng) Bcl-xs存在時，優(yōu)先形成 Bcl-

23、xs/Bcl-2 ， 使 Bax/Bax形式保留，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 第四節(jié) 檢測細(xì)胞凋亡的常用技術(shù) 一、凋亡的形態(tài)學(xué)檢查（光鏡、電鏡） 1 蘇木素 伊紅（ HE）染色法 : 應(yīng)用范圍： 石蠟組織切片、細(xì)胞涂片 結(jié)果判斷： 正常細(xì)胞保持原生長形狀，梭形或多角形；細(xì)胞核 呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡黃色。 凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核染色致密濃縮、核碎裂；凋亡細(xì) 胞涂片可見凋亡小體。 壞死細(xì)胞呈均質(zhì)紅染，無結(jié)構(gòu)、核染色消失。 2. 甲基綠 派諾寧染色法 : 3. Giemsa 染色法 : 4. 瑞氏 (Wright)染色法 5. 透射電子顯微鏡觀察法 二、熒光顯微鏡觀察法 吖啶橙染色法、 Hoechst染色法 Hoech

24、st 染色法 （一）瓊脂糖凝膠電泳法 基本操作步驟： 染色體組 DNA提取 11.5%瓊脂糖電泳 (含 EB) 電泳后于紫外燈下觀察并照相留底 有無 200bp左右的 ladder出現(xiàn)作為判斷細(xì)胞 凋亡 亦可進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 . 三、凋亡細(xì)胞的生化特征的檢測 (二 ) 原位末端標(biāo)記技術(shù) (in situ end lableing, ISEL) 原理 : ISEL的原理是基于細(xì)胞凋亡時， DNA斷裂，利 用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ TdT）或 DNA聚合酶將 帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（ biotin-16-dUTP）摻入 到斷裂的 DNA的 3端，再使其與帶有辣根過氧化物 酶的抗生物蛋白結(jié)合，

25、經(jīng) DAB顯色后，便可觀察到 細(xì)胞內(nèi)是否存在 DNA片段端存在。 主要方法有 2種 : 1. TdT介導(dǎo)的 dUTP缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 2. DNA聚合酶 I 或 klenow大片段介導(dǎo)的原位的缺口平 移 (ISNT) 該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細(xì)胞 . 四、凋亡細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測 基本操作步驟 : 離心收集細(xì)胞 -重懸于 70%乙醇 ,-20 固定 24小時 -離心后重懸細(xì)胞 PBS緩沖液 -加 PI （碘化丙啶）染色 (含 RNaseA), 37 保溫 30min-流式細(xì)胞術(shù)分析 亦可用 PI/Hoechst雙染 . 通過亞二倍體峰的的有無及面積積分來評斷 細(xì)胞凋

26、亡 . 第六節(jié) 細(xì)胞凋亡與臨床疾病 機(jī)體的生存取決于機(jī)體是否于平衡狀態(tài)， 而最重要的平衡是細(xì)胞數(shù)量的平衡，這種平衡 又取決于細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡（及壞死）。 細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物體內(nèi)一個重要的生 命現(xiàn)象，既可發(fā)生在個體發(fā)育過程和成體正常 生理過程；亦可發(fā)生疾病發(fā)生發(fā)展過程。 細(xì)胞凋亡的失調(diào)與許多疾病密切相關(guān)，包 括腫瘤、神經(jīng)變性、自身免疫、心臟疾病等。 細(xì)胞凋亡與疾病 細(xì)胞凋亡減少有關(guān) 細(xì)胞凋亡增加有關(guān) 1. 癌癥 : 淋巴癌 P53突變所致癌 依賴于激素引起的癌 2. 自身免疫性疾病 紅斑濃瘡 免疫介導(dǎo)的腎小管腎炎 3. 病毒感染 皰疹病毒 腺病毒 痘病毒 1. AIDS 2. 神經(jīng)退行性病變

27、 帕金森病 老年癡呆 3. 再生性障礙貧血 4. 缺血性損傷 心肌梗塞 腦卒中 再灌注損傷 5. 酒精肝 一、細(xì)胞凋亡自身免疫性疾病 正常情況下： 90%以上的淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育都會發(fā)生凋亡， 那些能識別自身抗原的細(xì)胞都應(yīng)被清除，確保被 選擇生存下來的淋巴細(xì)胞不至于對自身抗原產(chǎn)生 免疫應(yīng)答； 如果這種選擇性清除失敗，在靶細(xì)胞存在下，淋 巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的效應(yīng)細(xì)胞攻擊靶細(xì)胞， 導(dǎo)致發(fā)生自身免疫性疾病。 發(fā)病的分子機(jī)制： 淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵分子是細(xì)胞表 面受體 Fas（又稱 APO或 CD95）， Fas受體與 FasL （配體）結(jié)合即可激活凋亡信號傳導(dǎo)途徑， 細(xì)胞凋亡； T

28、細(xì)胞表面受體 Fas和 FasL發(fā)生突變時， T細(xì)胞不 能發(fā)生正常凋亡，導(dǎo)致自身免疫性疾病。 除系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?，還證實類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自 身免疫性糖尿病、牛皮癬均與淋巴細(xì)胞凋亡敏感性 改變（ Fas和 FasL突變）有關(guān)。 二、細(xì)胞凋亡病毒性疾病 現(xiàn)已證明，病毒的溶解性感染所產(chǎn)生的細(xì)胞病 變變作用與引發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)；而病毒的持續(xù)性感 染與病毒抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。 病毒感染引發(fā)細(xì)胞凋亡： 牛皰疹病毒、雞白血病毒 和 HIV等，均能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而引起宿主細(xì)胞 缺失。如 HIV感染后引起 CD4+T細(xì)胞凋亡而缺失。 病毒感染抑制細(xì)胞凋亡： 許多病毒具有抑制細(xì)胞凋 亡的機(jī)制，有利于建立持續(xù)感染、延長病毒復(fù)制時 間、以最大限度產(chǎn)生子代病毒。如 EB病毒產(chǎn)生 LMP-1，使 Bcl-2基因上調(diào)；牛痘病毒產(chǎn)生 crmA, 可抑制由 caspase所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 三、細(xì)胞凋亡與腫瘤 現(xiàn)已證明，腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常疾 病，同時也是細(xì)胞凋亡異常疾病。 大多數(shù)腫瘤 P53突變、而有些腫瘤過度表達(dá) Bcl-2 蛋白，這些可有效地以避免細(xì)胞凋亡發(fā)生。 P53蛋白作為 “ 基因警衛(wèi) ” 負(fù)責(zé)維持基因組的完整 性、 DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運轉(zhuǎn)。如果損 傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)， 使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。 Bcl-2屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞 壽命。