醫(yī)學(xué)交流課件：金納米棒在碘-125粒子肝癌治療中放射增敏作用的基礎(chǔ)研究

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1、金納米棒在碘-125粒子肝癌治療中放射增敏作用的基礎(chǔ)研究目錄一、研究背景二、研究?jī)?nèi)容 三、研究結(jié)果四、成果展示五、展望本研究受如下資金資助國(guó)家自然科學(xué)基金自助項(xiàng)目: 金納米棒聯(lián)合碘-125粒子植入治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究（81071240）研究背景1.肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第5位，死亡率居第3位。2.我國(guó)是全球肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家，全國(guó)腫瘤登記中心最新公布的2012年腫瘤登記年報(bào)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肝癌發(fā)病率為28.71/105，占所有惡性腫瘤的第4位(10.04)，而死亡率為26.04/105，占所有癌癥死亡的第2位，僅次于肺癌。 1Pakin DM,Bray F,Ferlay J,et

2、 al.Estimating the world cancer burden:Globocan 2002J.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-75.2葉勝龍.2013年肝癌領(lǐng)域新進(jìn)展.中華肝臟病雜志,2014,22:1-4.3.肝癌手術(shù)切除者僅為10左右，肝移植受到肝源的限制，因此，綜合各種手段治療肝癌已達(dá)成共識(shí)。4.肝癌屬于放射敏感性腫瘤,國(guó)內(nèi)外已有多篇臨床研究報(bào)道125I粒子組織間植入治療肝癌取得較好療效，其對(duì)于肝臟腫瘤的治療非常重要，因此研究新的放療方案，改善放療方法對(duì)晚期腫瘤病人的治療意義極大。男，男，64歲，肝癌術(shù)后歲，肝癌術(shù)后1年復(fù)發(fā)。年復(fù)發(fā)。 高分化腺

3、癌高分化腺癌術(shù)術(shù) 前前術(shù)后一月術(shù)后一月怎么克服125I粒子的缺點(diǎn)？增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射毒性，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞損傷，即研發(fā)應(yīng)用腫瘤靶向放療增敏劑，是提高125I粒子療效的策略之一。最近有文獻(xiàn)報(bào)道金納米顆粒對(duì)體外腫瘤細(xì)胞有放射增敏作用，金納米棒的增敏作用目前被廣泛關(guān)注。 4Gui C,Cui DX.Functionalized Gold Nanorods for Tumor Imaging and Targeted Therapy.Cancer Biol Med. 2012;9:221-233.5Liu CJ,Wang CH,Chen SH,et al.Enhancement of cell r

4、adiation sensitivity by pegylated gold nanoparticles.Phys Med Biol. 2010;55:931-945.放射的冷點(diǎn)及熱點(diǎn) 難以達(dá)到完全適形治療 腫瘤體積縮小，粒子邊緣化，對(duì)周?chē)＝M織的放射損傷5.但由于粒子植入過(guò)程中是人工操作，存在以下問(wèn)題：3Brent Herron, Alex Herron, Kathryn Howell,Daniel Chin and Luann Roads,A Review of Radiation Therapys Role in Early-Stage Breast Cancer and an Int

5、roduction to Electronic BrachytherapyJ.Cancer Treatment-Conventional and Innovative Approaches.2013(5)223-238.金納米棒對(duì)腫瘤放療增敏的機(jī)制金納米棒對(duì)腫瘤放療增敏的機(jī)制第一，輻射敏感材料的光電吸收橫截面直接取決于原子半徑大小。金原子(原子序數(shù)Z=79)比其他對(duì)輻射敏感的材料更敏感，如碳(Z=6)、碘(Z=53)、釓(Z=64)和鉑(Z=78)，通過(guò)光電效應(yīng)可以產(chǎn)生更強(qiáng)的輻射增強(qiáng)效果。第二，金納米棒的尺寸遠(yuǎn)大于金原子，其光電吸收截面積遠(yuǎn)超越金原子，所以在腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生的光電吸收劑量將顯著增

6、加。8Cho SH,Jones BL,Krishnan S.The dosimetric feasibility of gold nanoparticle-aided radiation therapy(GNRT) viabrachytherapy using low-energy gamma-/x-ray sources.Phys Med Biol.2009;54:4889-4905.第三，金納米棒的表面等離子共振特性，即當(dāng)光入射時(shí)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有強(qiáng)的光吸收能力和光熱光熱治療治療 ，增強(qiáng)的光吸收量也可有效增強(qiáng)腫瘤組織的吸收劑量。另外，金納米棒具有強(qiáng)光散射能力，也能間接增強(qiáng)腫瘤組織的輻射劑

7、量。9Park YS,Kasuya A,Dmytruk A,et al.Concentrated colloids of silica-encapsulated gold nanoparticles:colloidal stability,cytotoxicity,and X-ray absorption. Nanosci Nanotechnol.2007;7(8):2690-2695.如何能夠?qū)⒔鸺{米棒引入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，以期發(fā)揮更好的腫瘤靶向治療效果是本課題的關(guān)鍵所在！ 在納米粒子表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向治療，增強(qiáng)放療的同時(shí)，降低毒副作用，有

8、望在腫瘤的靶向性放療領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)突破。 用于靶向腫瘤的常見(jiàn)配體中，葉酸是葉酸受體的天然配體，葉酸受體在健康細(xì)胞的表達(dá)有限，但在上皮腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)。而肝癌屬于腺上皮來(lái)源，肝癌細(xì)胞表面具有豐富的FA 受體。本研究制備了一種新型的金納米材料葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒。6Franzen S A comparison of peptide and folate receptor targeting of cancer cells: from single agent to nanoparticleJExpert Opin Drug Deliv，2011，8：281.7DAngelica M, Amm

9、ori J, Gonen M,et al. Folate receptor-alpha expression in resectable hepatic colorectal cancer metastases: patterns and significance. Mod Pathol, 2011, 24:1221-1228.研究意義研究意義1 研發(fā)一種新型的復(fù)合納米顆粒，通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究探討其腫瘤靶向能力的強(qiáng)弱。2 探討納米金對(duì)125I的放射增敏作用，為納米金主動(dòng)靶向技術(shù)用作放射治療增敏劑奠定前期研究基礎(chǔ)。3 探討葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒（GNRsSiO2-FA）聯(lián)合125I粒

10、子誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制，為臨床提高肝癌125I粒子組織間植入療效提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容第一部分 制備GNRsSiO2-FA及其表征第二部分 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（1）建立碘-125粒子模型（2）GNRsSiO2-FA聯(lián)合125I粒子對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響第三部分 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（1）建立VX-2兔肝癌模型（2）VX-2兔肝癌模型對(duì)GNRsSiO2-FA攝取狀況的研究（3）GNRsSiO2-FA聯(lián)合125I粒子內(nèi)放療對(duì)兔VX2肝癌凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響技術(shù)路線技術(shù)路線放射增敏實(shí)驗(yàn)毒性及靶向?qū)嶒?yàn)偶聯(lián)葉酸表面氨基化二氧化硅包覆制備金納米棒制備金納米棒制備金納米棒偶聯(lián)葉酸

11、表面氨基化二氧化硅包覆制備金納米棒毒性及靶向?qū)嶒?yàn)偶聯(lián)葉酸表面氨基化二氧化硅包覆制備金納米棒第一部分 制備葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒及對(duì)其表征金納米棒制備金納米棒制備金種子（直徑5nm)在模板誘導(dǎo)下一維生長(zhǎng)成棒狀結(jié)構(gòu)?？刂萍尤虢鸱N子和銀離子的量就可以控制棒的長(zhǎng)度。二氧化硅包覆金納米棒二氧化硅包覆金納米棒溶膠凝膠法溶膠凝膠法硅源試劑硅源試劑（TEOS）二氧化硅包覆的金納米是一種核-殼結(jié)構(gòu)。葉酸偶聯(lián)金納米棒的制備葉酸偶聯(lián)金納米棒的制備葉酸葉酸共價(jià)鍵共價(jià)鍵葉酸的生物功能主要是由分子中的2-氨基-4-羥基-6-甲基蝶呤功能基團(tuán)提供的，我們利用羧基與氨基反應(yīng)生成共價(jià)鍵，不會(huì)影響葉酸的生物功能。表征表征

12、通過(guò)透射電鏡、掃描電鏡、電子衍射、紫外紅外吸收光譜等對(duì)葉酸偶聯(lián)金納米棒進(jìn)行表征。金納米棒表征金納米棒表征紫外吸收光譜紫外吸收光譜圖1a金納米棒UV吸收?qǐng)D譜（516 nm和712 nm ） 圖1b 不同長(zhǎng)度金納米棒UV吸收?qǐng)D譜紫外吸收?qǐng)D譜：金納米棒有兩個(gè)特征吸收峰，橫向SPR及縱向SPR，縱向SPR是光熱治療的物理基礎(chǔ)。（SPR，表面等離子體共振）紫外吸收?qǐng)D譜：橢球形二氧化硅殼層包覆前后金納米棒兩個(gè)特征吸收峰位置基本沒(méi)有發(fā)生變化。GNRSiO2-FA出現(xiàn)了葉酸苯環(huán)的特征峰，證實(shí)葉酸偶聯(lián)成功。圖1c 橢球形GNRSiO2 UV圖譜 圖1d FA和GNRSiO2-FA UV圖譜二氧化硅包覆的金納米棒

13、二氧化硅包覆的金納米棒UV二氧化硅包覆的金納米棒二氧化硅包覆的金納米棒掃描電鏡、掃描電鏡、電子衍射電子衍射圖2 橢球形GNRSiO2 TEM圖 圖3 GNRSiO2 電子衍射圖 電子衍射圖：陣代表單晶的金納米棒，圓環(huán)代表非晶的二氧化硅，證實(shí)了核-殼結(jié)構(gòu)。金納米棒的表征電鏡下觀察 圖3 金納米棒TEM圖（15000X） 圖4 金納米棒TEM圖（600KX）TEM：金納米棒大小均一，分散性較好金納米棒大小均一，分散性較好(這是評(píng)價(jià)納米材料性質(zhì)的主要指標(biāo)之一），這是評(píng)價(jià)納米材料性質(zhì)的主要指標(biāo)之一），高倍電鏡可以清除地觀察金納米棒的晶格結(jié)構(gòu)。高倍電鏡可以清除地觀察金納米棒的晶格結(jié)構(gòu)。金納米棒的表征電鏡

14、下觀察圖5 金納米棒SEM圖（600KX）二氧化硅包覆的金納米棒表征二氧化硅包覆的金納米棒表征透射電鏡觀察透射電鏡觀察 圖4 橢球形GNRSiO2 TEM圖(包覆層較厚） 靶向納米探針靶向納米探針體外生物安全性體外生物安全性和靶向性實(shí)驗(yàn)和靶向性實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞MTT法檢測(cè)生物相容性ICP-MS檢測(cè)靶向性體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)加藥A組，加藥B組分別加入GNRsSiO2-FA、GNRs，金元素含量分別為2.5 、5、10、20、40ppm。細(xì)胞存活率=1（對(duì)照組加藥組）/對(duì)照組100%。 MTT法檢測(cè)OD值96孔板培養(yǎng)肝HepG2細(xì)胞加藥A組調(diào)零組對(duì)照組加藥B組GNRsSi

15、O2-FA細(xì)胞攝入的靶向性檢測(cè)結(jié)細(xì)胞攝入的靶向性檢測(cè)結(jié)果果組別組別 培養(yǎng)時(shí)間（培養(yǎng)時(shí)間（h h）24 816 24 GNRsSiOGNRsSiO2 2 組組256.73.3 602.82.41067.13.61998.54.3 2078.51.3 GNRsSiOGNRsSiO2 2-FA-FA組組693.12.0 1432.02.6 2331.33.5 2484.55.0 2589.72.1 F F 值值 P P 值值3278.070p0.0134287.199p0.0185434.870p0.0118333.454p0.0142412.973p0.01培養(yǎng)2 h時(shí)，GNRsSiO2-FA組的

16、細(xì)胞攝取率遠(yuǎn)高于GNRsSiO2組，是其攝入量的2.7倍，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組之間的差距逐漸減小；超過(guò)16h，兩組細(xì)胞攝入量均開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞攝入率變化較?。ū?），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 電鏡觀察細(xì)胞攝取納米顆粒電鏡觀察細(xì)胞攝取納米顆粒1 h后，可觀察到已有GNRsSiO2-FA與細(xì)胞膜接觸，細(xì)胞伸出偽足（圖5）；共同孵育4 h后，有更多的納米顆粒與細(xì)胞膜接觸，并有膜樣結(jié)構(gòu)的吞噬泡形成，細(xì)胞質(zhì)中有少量的金納米顆粒(圖6)；GNRsSiO2-FA 與HepG2細(xì)胞培養(yǎng)電鏡下觀察結(jié)果，培養(yǎng)1 h（圖5），培養(yǎng) 4 h（圖6）GNRsSiO2-FA 與HepG2細(xì)胞培養(yǎng)電鏡下觀察

17、結(jié)果，培養(yǎng)12 h（圖7），培養(yǎng) 24 h（圖8）12 h后見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量金納米顆粒，部分靠近細(xì)胞核的邊緣，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)納米顆粒(圖7)。24 h后有的納米顆粒已與細(xì)胞核膜接觸，但金納米顆粒依然主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)金納米顆粒(圖8)結(jié)果1、種子生長(zhǎng)法制備金納米棒需使用表面活性劑CTAB，其具有生物毒性，本實(shí)驗(yàn)采用二氧化硅為殼材包覆金納米棒，以去除CTAB的毒性。2、紫外吸收?qǐng)D譜和電鏡圖片表明： 二氧化硅包覆后，對(duì)金納米棒本身的光學(xué)特性及形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響。3、MTT比色法實(shí)驗(yàn)表明： 表面修飾后的金納米棒溶液對(duì)細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)小于金納米棒，對(duì)體外肝癌細(xì)胞生物安全性很好，這為我們下一步細(xì)胞實(shí)

18、驗(yàn)提供了可行性。ICP-MS法測(cè)GNRSiO2-FA表面葉酸的靶向性說(shuō)明：1、納米表面的葉酸具有很強(qiáng)的靶向性，可以在短時(shí)間內(nèi)大量與葉酸受體結(jié)合。2、納米粒子除了依靠葉酸受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞作用外，還可以通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，只是胞吞入胞的效率相對(duì)較低。第二部分 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外粒子照射示意圖體外粒子照射示意圖圖9.GARY實(shí)驗(yàn)室體外粒子照射實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪疽鈭D10Aird EG,Folkard M,Mayes CR,et al.A purpose-built iodine-125 irradiation plaque for low dose rate low energy irradiation of

19、 cell lines in vitroJ.Br J Radiol, 2001,74:56261.碘粒子模型碘粒子模型1.采用聚苯乙烯塑料圓盤(pán)直徑為1cm，厚度1mm，在圓盤(pán)底部扎出深約1mm的凹槽用來(lái)固定9粒125I粒子，1粒位于正中,8粒再距圓心30mm處環(huán)形等距離排布；2.采用細(xì)胞培養(yǎng)器皿直徑為35mm，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液常規(guī)體外培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞。3.再采用同樣規(guī)格聚苯乙烯圓盤(pán)位于粒子盤(pán)的上方5mm用來(lái)放置細(xì)胞培養(yǎng)皿，粒子盤(pán)的正下方也放置一細(xì)胞培養(yǎng)皿，一同接受125I粒子照射，這樣一組粒子可以用來(lái)照射2組細(xì)胞，節(jié)約了粒子成本。4.放射防護(hù)裝置是一高度為約為100mm的拱形鉛帽P(pán)b厚度為0

20、.50mm，同時(shí)將粒子盤(pán)和培養(yǎng)皿置入鉛帽內(nèi)，最后一同放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鉛帽的兩側(cè)稍微撐起，使其通風(fēng)，細(xì)胞培養(yǎng)不受影響。在照射總時(shí)間的一半要將上下方細(xì)胞培養(yǎng)皿順時(shí)針旋轉(zhuǎn)22.5，使細(xì)胞培養(yǎng)皿所在平面接受照射的劑量率誤差減小。碘粒子模型碘粒子模型圖10a放置細(xì)胞培養(yǎng)皿125I的 b碘125粒子模型 c粒子盤(pán)上下均放置一個(gè)聚苯乙烯盤(pán)(實(shí)物) 細(xì)胞培養(yǎng)皿的125I粒子模型體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞空白對(duì)照組碘125粒子治療組葉酸偶聯(lián)的金納米棒組 碘125粒子+葉酸偶聯(lián)的金納米棒組倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)bcl-2、bax、ki67蛋白表達(dá)west

21、ern-blot及RT-PCR檢測(cè)bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平表3 4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較組別例數(shù)(n)細(xì)胞凋亡率(%)空白對(duì)照組105.911.52單純金納米棒組1010.163.18單純125I粒子照射組1020.784.79*金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組1033.418.00*F值 99.82P值 0.00注：與空白對(duì)照組、單純GNRsSiO2-FA組比較，*P0.05細(xì)胞凋亡率的測(cè)定細(xì)胞凋亡率的測(cè)定圖11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡情況注：空白對(duì)照組；單純金納米棒組；單純125I粒子照射組；金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組結(jié)果結(jié)果1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋

22、亡率：金納米棒聯(lián)合放療組比單純放療組的凋亡率高。2.western-blot及RT-PCR顯示GNRsSiO2-FA+125I粒子組bcl-2明顯下調(diào)，caspase-3、bax明顯上調(diào)。3.細(xì)胞免疫化學(xué)：4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2及增殖核抗原Ki67蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；聯(lián)合組較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，Bcl-2、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第三部分 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法及步驟 兔兔VX2VX2肝癌模型的建立肝癌模型的建立 兔兔VX-2VX-2肝癌模型的影像學(xué)

23、檢查及病理結(jié)果肝癌模型的影像學(xué)檢查及病理結(jié)果激光掃描共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)GNRsSiOGNRsSiO2 2-FA-FA攝取情況攝取情況 應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測(cè)應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測(cè)GNRsSiOGNRsSiO2 2-FA-FA聯(lián)合聯(lián)合 125125I I粒子內(nèi)放療的腫瘤細(xì)胞凋亡率粒子內(nèi)放療的腫瘤細(xì)胞凋亡率 兔兔VX2肝癌模型的建立肝癌模型的建立1.在無(wú)菌條件下將兔用戊巴比妥鈉（30mg/kg）靜脈全麻后手術(shù)剝離荷瘤兔后腿肌肉內(nèi)腫塊，將從荷瘤兔體內(nèi)取出的生長(zhǎng)活躍的腫瘤組織用手術(shù)剪剪碎至1-2mm3的小塊。2.實(shí)驗(yàn)兔全麻后，常規(guī)肋下CT掃查待接種兔肝臟，明確兔肝

24、位置并確定待接種部位，用帶尖頭穿刺針芯穿刺針沿設(shè)定的穿刺角度、方向穿入預(yù)定肝位置，眼科鑷夾1塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù)1-2次。在直視下來(lái)回在針鞘內(nèi)推動(dòng)平頭穿刺針芯，證實(shí)瘤塊接種于肝臟。術(shù)后連續(xù)3天青霉素40萬(wàn)U+慶大霉素4萬(wàn)U肌注。兔兔VX-2肝癌模型的影像學(xué)檢查肝癌模型的影像學(xué)檢查圖15. a.CT 平掃: 肝左內(nèi)葉腫瘤,呈低密度結(jié)節(jié)狀, 類(lèi)圓形, 邊緣較清楚。b、c.CT 增強(qiáng): 動(dòng)脈期腫瘤實(shí)體部分強(qiáng)化明顯,其內(nèi)可見(jiàn)一小強(qiáng)化結(jié)節(jié)( 紅箭頭) ；靜脈期腫瘤強(qiáng)化程度低于正常肝實(shí)質(zhì)。圖16 HE染色后顯微鏡下圖象。（a）低倍光鏡下（10），正常肝組織內(nèi)見(jiàn)多灶浸潤(rùn)性癌巢,

25、 與正常肝實(shí)質(zhì)分界清楚 。（b）高倍鏡下(40X)，可見(jiàn)癌細(xì)胞核大,深染 ,核分裂多，并可見(jiàn)少量壞死組織。兔兔VX-2肝癌模型的病理結(jié)果肝癌模型的病理結(jié)果激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)GNRsSiO2-FA對(duì)肝癌細(xì)胞靶向性對(duì)肝癌細(xì)胞靶向性1.隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成三組，分為A、B、C三組，每組9只。2.A組為空白對(duì)照組: 植入腫瘤后2周，從耳緣靜脈注射生理鹽水5ml。B組為門(mén)靜脈組：在超聲引導(dǎo)下，辨別并確定兔門(mén)靜脈主干位置，向門(mén)靜脈內(nèi)注射GNRsSiO2-FA 200ul。C組為瘤內(nèi)注射組:在超聲引導(dǎo)下，向腫瘤組織內(nèi)注射GNRsSiO2-FA 200ul。3.術(shù)后24h、48h、

26、72h采用空氣栓塞法，每組各處死3只實(shí)驗(yàn)兔，取其腫瘤組織和各主要臟器（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺）做后續(xù)檢測(cè)。共聚焦顯微鏡觀察肝癌模型對(duì)共聚焦顯微鏡觀察肝癌模型對(duì)GNRsSiO-FA攝攝取情況取情況圖17 GNRsSiO2-FA在不同組織的共聚焦圖像。（a）腫瘤組織的自發(fā)熒光和GNRsSiO2-FA熒光的發(fā)射光譜。（b）在770nm近紅外激光激發(fā)下，檢測(cè)450-550nm范圍內(nèi)的共聚焦圖像，GNRs（亮點(diǎn)）和腫瘤組織自發(fā)熒光都可以清楚觀察到。（c）在相同區(qū)域，當(dāng)檢測(cè)范圍為650-700nm時(shí)，只有GNRs可以觀察到。（d）GNRsSiO2-FA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，并在腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚（藍(lán)色箭頭），

27、腫瘤細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GNRs。圖18 在攝入GNRsSiO2-FA后不同時(shí)間段（24h、48h、72h），GNRsSiO2-FA瘤內(nèi)注射組動(dòng)物體內(nèi)，腫瘤組織及各主要器官對(duì)GNRsSiO2-FA的攝取狀況。標(biāo)尺=10m不同時(shí)間段不同時(shí)間段4組肝癌細(xì)胞凋亡組肝癌細(xì)胞凋亡率比較率比較組別 細(xì)胞凋亡率（%）24h48h72h1w2w3w空芯125I對(duì)照組5.435.430.710.715.525.520.380.385.325.320.670.676.016.010.440.445.715.710.490.495.315.310.660.66GNRsSiO2-FA組10.2110.210.680.68

28、* *10.7810.780.770.77* *11.3211.320.640.64* *16.2216.221.231.23* *16.2216.221.281.28* *15.3215.321.581.58* *125I 粒子植入組5.465.460.680.686.136.130.530.5312.1312.130.430.43* *18.5218.520.610.61* *27.6527.650.390.39* *25.3125.310.810.81* *聯(lián)合組10.2210.220.630.6318.2118.210.560.5625.3325.330.270.2732.2632.2

29、61.031.0344.0144.010.780.7840.7940.790.430.43*P0.05,與對(duì)照組比較；P0.05,與聯(lián)合組比較。表5 4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果結(jié)果1.成功建立VX-2兔肝癌模型，CT、超聲檢查觀察顯示腫瘤血供較豐富。2.共聚焦顯微鏡觀察到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝入GNRsSiO2-FA后，在24h內(nèi)GNRsSiO2-FA即可以特異性的與腫瘤細(xì)胞結(jié)合進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并聚集在腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組肝癌細(xì)胞凋亡率，單純金納米棒組、單純125I 粒子照射組較空白對(duì)照組均有升高（P 0.05），聯(lián)合組較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

30、意義（P 0.05）。結(jié)論結(jié)論1. 制備成的葉酸偶聯(lián)的金納米棒探針，在細(xì)胞內(nèi)生物安全性好，并可以特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞，葉酸受體可作為腫瘤靶向治療的理想靶點(diǎn)。2.GNRsSiO2-FA可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)高度靶向性作用于肝癌細(xì)胞，在腫瘤的靶向定位熱療和125I 粒子介入治療方面具有重要的應(yīng)用前景。2. 納米金可增強(qiáng)125I對(duì)組織的輻射損傷作用，提高細(xì)胞的放射敏感性。金納米棒與125I粒子聯(lián)合應(yīng)用能更有效增加肝癌細(xì)胞凋亡率。展望這種新穎的靶向納米探針在光熱治療、放療增敏和分子影像等領(lǐng)域具有潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值。本研究證實(shí)金納米棒聯(lián)合125I粒子具有明顯的協(xié)同抗腫瘤效果，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金納米棒聯(lián)合125I粒

31、子的研究尚不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)在分子水平上為金納米棒聯(lián)合125I粒子治療肝癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),但其明確生物學(xué)機(jī)制尚待更深入的研究。謝謝！靶向性實(shí)驗(yàn)靶向性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組加入GNRsSiO2 100 l，實(shí)驗(yàn)組加入GNRsSiO2-FA 100 l計(jì)算公式：Au元素質(zhì)量/（細(xì)胞脫水后質(zhì)量+與細(xì)胞偶聯(lián)的GNRsSiO2-FA質(zhì)量）6孔板培養(yǎng)細(xì)胞分實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別加藥100ul分2、4、8、16、24h收集細(xì)胞細(xì)胞烘干至恒重稱(chēng)量重量ICP-MS法測(cè)Au元素含量并計(jì)算王水溶解后配至10ml表表1 1 GNRs與與GNRsSiO2-FA對(duì)對(duì)HepG2細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果組別GNRsSiO2-FA組GNR

32、s組 F 值 P 值 (A值) 存活率（%）(A值) 存活率（%）對(duì)照孔0.6740.0131000.6740.013100金元素濃度40.010-6組0.6220.016 92.30.398 0.012 59.1191.876 p0.0120.010-6組0.6310.021 93.60.4340.025 71.8265.419 p0.0110.010-6組0.6430.034 95.40.5430.024 80.577.987 p0.015.0 10-6組0.6650.023 98.70.5750.031 85.352.061 p0.012.510-6組0.6700.03299.40.61

33、40.03491.118.745 p0.01細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率細(xì)胞凋亡率1.植入腫瘤后2周，隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成四組，分為A、B、C、D四組，每組6只。2.A組:單純125I粒子植入組，在CT導(dǎo)引下將活度為0.9mCi125I粒子植入腫瘤組織內(nèi)，植入粒子數(shù)根據(jù)粒子治療計(jì)劃系統(tǒng)（TPS）計(jì)算確定；B組:金納米棒治療組,從兔耳緣靜脈注入GNRsSiO2-FA 200L；C組：聯(lián)合治療組,在CT導(dǎo)引下將活度為0.9mCi 125I粒子植入腫瘤組織內(nèi)，并從耳緣靜脈注入GNRsSiO2-FA 200L；D組:對(duì)照組，在CT導(dǎo)引下植入相同數(shù)量的同規(guī)格的空心125I

34、粒子。3.對(duì)應(yīng)的粒子植入即刻、24h、48h、72h、1w、2w、3w各組在CT導(dǎo)引下取距粒子0.5cm及1.5cm處瘤旁組織，處理成細(xì)胞懸液，測(cè)量細(xì)胞凋亡率。 圖 12 RT-PCR檢測(cè)金納米棒聯(lián)合125I粒子照射作用于肝癌HepG2細(xì)胞后Bax、Bcl-2、GAPDH mRNA表達(dá)注：1.DNA Marker；2.空白對(duì)照組；3.單純金納米棒組；4.單純125I粒子照射組；5.金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組 Western BlotWestern Blot檢檢測(cè)結(jié)果測(cè)結(jié)果ControlGNRsSiO2-FARadiotherapy(RT)GNRsSiO2-FA+RT Bcl-2 Caspa

35、se-3 Bax GAPDH圖13 空白對(duì)照、GNRsSiO2-FA、放療（RT）及GNRsSiO2-FA+RT對(duì)HepG2細(xì)胞中Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表達(dá)的影響圖14 4組肝癌HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2、KI表達(dá)情況 注：a:空白對(duì)照組；b:單純金納米棒組；c:單純125I粒子照射組；d:金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組（SPX400）近年來(lái)已發(fā)表的期刊近年來(lái)已發(fā)表的期刊1、鮑樂(lè)，黃鵬，高斌，崔大祥.簡(jiǎn)便合成橢球形二氧化硅包覆的金納米棒. 東華學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，36(5).2.余金妹，高 斌，賀克武等.金納米棒的表面改性及生物相容性J.中國(guó)組織工程研究，2

36、012，16(38): 7068-7072.3.李?lèi)?ài)華，高斌，賀克武，肖衛(wèi)華.橢球形金納米棒作為癌細(xì)胞靶向探針的研究J.介入放射學(xué)雜志，2013,22（4）：312-316.4.高斌，李?lèi)?ài)華，賀克武，肖衛(wèi)華.葉酸偶聯(lián)金納米棒靶向探針制備及體外肝癌細(xì)胞對(duì)其攝取狀況的研究J.中華放射學(xué)雜志，2013，,47（7）：654-658.5.沈蕾,高斌,賀克武.金納米顆粒在腫瘤放射增敏治療中的應(yīng)用：如何最大效應(yīng)利用金納米棒？中國(guó)組織工程研究雜志,2014,18（39）：6369-6374.6.沈蕾,高斌，賀克武,肖衛(wèi)華.金納米棒聯(lián)合125I粒子誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究J.介入放射學(xué)雜志,2015,3(24):236-241.7.沈蕾,高斌，賀克武,肖衛(wèi)華.金納米棒對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞放射增敏性影響的研究J.中華放射學(xué)雜志(2015年6月見(jiàn)刊).8.許軍 ,賀克武 ,高斌等.VX-2兔肝癌模型的建立及其對(duì)葉酸偶聯(lián)金納米棒攝取狀況的研究J.介入放射學(xué)雜志，2015，4（25）:345-349.9.許軍 高斌 賀克武等.葉酸偶聯(lián)金納米棒聯(lián)合125I粒子內(nèi)放療對(duì)兔VX2肝癌凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響J.當(dāng)代介入醫(yī)學(xué)電子雜志，2015,1（1）:37-42.