第五章 重組DNA技術(shù)

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1、 第五章第五章 分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)DNADNA重組技術(shù)及應(yīng)用重組技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個世現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個世紀(jì)中葉以來研究方法、特別是基因操作和基紀(jì)中葉以來研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕ɑ虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)

2、?；蚧蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。繁衍與性狀表達(dá)。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程因置于新的寄

3、主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。重組重組DNADNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件技術(shù)發(fā)展史上的重大事件三大成就：三大成就：一、在一、在2020世紀(jì)世紀(jì)4040年代確定了遺傳信息的攜年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是帶者、即基因的分子載體是DNADNA而不是蛋白而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制型和半保留復(fù)制機(jī)制, ,解決了基因的自我復(fù)解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；制和世代交替問題；三、三

4、、5050年代末至年代末至6060年代，相繼提出了年代，相繼提出了“中心法中心法則則”和操縱子學(xué)說和操縱子學(xué)說, ,成功地破譯了遺傳密碼，闡成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具（一）（一）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位上的特定堿基序列并從這個位點(diǎn)切開點(diǎn)切開DNA分子。分子。第一個核酸內(nèi)切酶第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是是Boyer實驗室在實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序序列，將雙鏈列，將雙鏈DNA分子在這個位點(diǎn)

5、切開并產(chǎn)生分子在這個位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。具有粘性末端的小片段。 圖圖5-1 幾種主要幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端其酶切末端。（二）基因克隆的載體（二）基因克隆的載體 我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和酶和DNA連接酶進(jìn)行連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，的切割和重組，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足基因工程的要求，因為大多還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足基因工程的要求，因為大多數(shù)數(shù) DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，只有片段不具備自我復(fù)制的能力，只有將他們連接到具備自主復(fù)制能力的將他們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子分子上，才能在寄主細(xì)

6、胞中進(jìn)行繁殖。上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。載體（載體（vector)是指具備自主復(fù)制的是指具備自主復(fù)制的DNA分子，分子，象病毒、噬菌體和質(zhì)粒等相對分子量較小的復(fù)象病毒、噬菌體和質(zhì)粒等相對分子量較小的復(fù)制子均可以作為基因?qū)氲妮d體。制子均可以作為基因?qū)氲妮d體。載體三要素：載體三要素： 自我復(fù)制能力；自我復(fù)制能力； 攜帶外源基因片段大小（具有較小的分子攜帶外源基因片段大?。ň哂休^小的分子量和較高的拷貝數(shù)）；量和較高的拷貝數(shù)）； 插入位點(diǎn)多少（具有若干限制酶單一識別插入位點(diǎn)多少（具有若干限制酶單一識別位點(diǎn)）；位點(diǎn)）；易于鑒定識別（具有抗菌素抗性基因）易于鑒定識別（具有抗菌素抗性基因）大腸桿菌質(zhì)

7、粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體: 1、pSC101質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細(xì)胞僅有體，平均每個寄主細(xì)胞僅有12個拷貝。個拷貝。 長長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及以及SmaI等等7種限制性核酸內(nèi)切酶的種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和和SalI等等3個位點(diǎn)插入外源基因，會導(dǎo)致個位點(diǎn)插入外源基因，會導(dǎo)致tetr失活。失活。 大腸桿菌大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體質(zhì)粒

8、載體示意圖。示意圖。是第一個真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種是第一個真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取的寄主細(xì)胞中提取pSC101 DNA，產(chǎn)量很低。產(chǎn)量很低。2、ColE1質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。 一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長也隨之停止。細(xì)胞的生

9、長也隨之停止。 而松弛型質(zhì)粒而松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時，使每卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時，使每個寄主細(xì)胞中個寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到10003000個，占細(xì)胞總個，占細(xì)胞總DNA的的50%左右。左右。3、pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體由三個不同來源的部分組成的：由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子質(zhì)粒易位子Tn3的氨的氨芐青霉素抗性基因（芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來源于第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（因（tetr）；）；第三部分則來源于第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒的派生質(zhì)粒p

10、MB1的的DNA復(fù)制起點(diǎn)（復(fù)制起點(diǎn)（ori）。）。AmpR優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量，其長度為優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量，其長度為4 363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外的外源源DNA片段，操作起來仍較為便利。片段，操作起來仍較為便利。具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。記號。有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增，有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增，每個細(xì)胞中可累積每個細(xì)胞中可累積1000300010003000個拷貝，為重組體個拷貝，為重組體DNADNA的制備提供了極大的方便。的制備提供了極大的方便。4

11、、pUC質(zhì)粒載體（包括四個部分）：質(zhì)粒載體（包括四個部分）：(i)來自來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（氨芐青霉素抗性基因（ampr）；）；(iii)大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖酶基因（半乳糖酶基因（lacZ）的啟動的啟動子及其編碼子及其編碼-肽鏈的肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱序列，此結(jié)構(gòu)特稱為為lacZ基因；基因；(iv)位于位于lacZ 基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段多端的一段多克隆位點(diǎn)（克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破區(qū)段，外源基因插入后破壞了壞了lacZ 基因的功能。基因的功能。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。

12、在更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時，僅保留下其中的質(zhì)粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，其分子小了氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，其分子小了許多，許多，pUC8為為2750bp，pUC18為為2686bp。由由于缺失于缺失rop基因，基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素擴(kuò)增時，質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素擴(kuò)增時，平均每個細(xì)胞即可達(dá)平均每個細(xì)胞即可達(dá)500700個拷貝個拷貝?？捎媒M織化學(xué)方法檢測重組體?？捎媒M織化學(xué)方法檢測重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌中具有來自大腸桿菌lac操縱子的操縱子的lacZ基因，基因，所編碼的所編碼的-肽鏈可參與

13、肽鏈可參與-互補(bǔ)作用。因此，可互補(bǔ)作用。因此，可用用X-gal顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。具有多克隆位點(diǎn)具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以把具兩種不同區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如粘性末端（如EcoRI和和BamHI）的外源的外源DNA片片段直接克隆到段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。質(zhì)粒載體上。5、 pGEM-3Z質(zhì)粒質(zhì)粒 長度為長度為2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個性基因和一個lacZ基因?；颉?含有兩個噬菌體啟動子（含有兩個噬菌體啟動子（T7和和SP6），為），為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別聚合酶的附著

14、作用提供了特異性的識別位點(diǎn)。加入位點(diǎn)。加入T7或或SP6 RNA聚合酶，所克隆的聚合酶，所克隆的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。6、穿梭質(zhì)粒載體（、穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vector） 指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活選擇記號，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以保證外源保證外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增，能在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭，到擴(kuò)增，能在原核和真核細(xì)胞

15、之間往返穿梭，具有廣泛的用途。具有廣泛的用途。7、pBluescript噬菌粒載體噬菌粒載體 pBluescript是指由是指由Stratagene公司發(fā)展的一公司發(fā)展的一類從類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），），如今則更多地叫作如今則更多地叫作pBluescript KS（+/-）或）或pBluescript SK（+/-）。）。 SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的取向，即表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的取向，即lacZ基因是基因是按照按照SacIKpnI的方向轉(zhuǎn)錄；的方向轉(zhuǎn)錄； （+/ -）表示單鏈?zhǔn)删w）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反

16、的取向。反的取向。 f1（+）起點(diǎn)表示當(dāng)起點(diǎn)表示當(dāng)pBluescript噬菌粒載體和噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時，能夠回收到輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈基因的有意義鏈DNA；而；而f1（-）起點(diǎn)則起點(diǎn)則表示當(dāng)表示當(dāng)pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時，可回收到感染寄主細(xì)胞時，可回收到lacZ基因的無意基因的無意義鏈義鏈DNA。(i)在多克隆位點(diǎn)區(qū)（在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對的兩側(cè)，存在一對T3和和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導(dǎo)插入在噬菌體的啟動子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)

17、錄活動；多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；(ii)具有單鏈?zhǔn)删w具有單鏈?zhǔn)删wM13或或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個的復(fù)制起點(diǎn)和一個來自來自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈雙鏈DNA；(iii）編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記；化子克隆的選擇標(biāo)記；(iv)含有一個含有一個lacZ基因，可以按照基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法

18、篩選噬菌粒載體的重組子。組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。LacZ編碼編碼-半乳糖苷酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的個氨基酸的-肽，肽， IPTG（異丙基（異丙基- -D-硫代半乳糖苷）誘硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)導(dǎo)該基因表達(dá)，合成的該基因表達(dá)，合成的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽能與肽能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶相互補(bǔ)，半乳糖苷酶相互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，能水解外源加入半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳半乳糖苷），生成藍(lán)色的溴氯吲哚，使生長于含糖苷），生成藍(lán)色的溴氯吲哚，使生

19、長于含X-gal培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍(lán)色。培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍(lán)色。重組重組DNADNA操作過程示意圖操作過程示意圖圖圖5-2 DNA連接酶能把不同的連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體片段連接成一個整體 僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆分子就是分子克隆的載體（的載體（vector）。）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。獲得了用外源獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成片段和載體分子重組而成的雜種的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為分子后，還必須通過一個被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組才能保證重組DNA分子的增殖（圖分子的增殖（圖5-3）。）。 圖圖5-3 重組重組DNA操作過程示意圖操作過程示意圖