分子生物學(xué)學(xué)習(xí)課件：第八部分重組DNA技術(shù)

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1、目目 錄錄 DNA的合成及重組的合成及重組 DNA Biosynthesis and Recombination第十六章第十六章目目 錄錄n接合作用接合作用(conjugation) 當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移到另一細胞（細菌）的從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移到另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移作用。轉(zhuǎn)移作用。n轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用(transformation) 通過自動獲取通過自動獲取/人為供給外源人為供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新遺傳表型的作用。體細胞獲得新遺傳表型的作用。n轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)作用(transduction) 當當病毒（如噬菌體）病毒（如噬菌體）從被感染的細胞（供體）釋放出從被感染的細胞（供體）釋放出來，再次感染另一細胞（受體）時，發(fā)生在供體細胞來，再次感染另一細胞（受體）時，發(fā)生在供體細胞和受體細胞之間的和受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移和基因重組。轉(zhuǎn)移和基因重組。n轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)目目 錄錄n在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)座的過程中，整段在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)座的過程中，整段DNA在細胞在細胞內(nèi)、細胞間或不同物種間進行轉(zhuǎn)移，并發(fā)生內(nèi)、細胞間或不同物種間進行轉(zhuǎn)移，并發(fā)生DNA分子間的共價連接。分子間的共價連接。目目 錄錄n同源重組同源重組(homologous rec

3、ombination，HR) 是指發(fā)是指發(fā)生在生在同源序列間同源序列間的重組，它通過鏈的斷裂和再連接，的重組，它通過鏈的斷裂和再連接，在兩個在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。又稱交換。又稱基本重組基本重組(general recombination)。n同源重組同源重組不需要特異不需要特異DNA序列，而是依賴兩分子之序列，而是依賴兩分子之間序列的相同或類似性間序列的相同或類似性。 如果通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)獲如果通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的外源得的外源DNA與宿主與宿主DNA充分同源，則可以整合充分同源，則可以整合進宿主的染色體中。進宿主的染色體中。n在真核

4、生物和原核生物中均有發(fā)生在真核生物和原核生物中均有發(fā)生目目 錄錄以以E.coli的同源重組為例的同源重組為例兩個同源染色體兩個同源染色體DNA排列整齊排列整齊一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體中間體通過通過分支移動分支移動產(chǎn)生異源雙鏈產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體重組體DNA目目 錄錄片段重組體片段重組體(patch recombinant)切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有異源雙鏈區(qū)，

5、其兩側(cè)來自同一親本有異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體含有異源切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體含有異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自不同親本雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自不同親本DNA。 目目 錄錄 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵擾侵擾(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體

6、中間體5 3 5 3 5 3 5 3 目目 錄錄Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶拼接重組體拼接重組體片段重組體片段重組體切開的鏈與原來切開的鏈與原來斷裂的是同一條斷裂的是同一條鏈鏈目目 錄錄n由由催化催化，在兩個，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的序列的特異位點間發(fā)生的整合稱整合稱位點特異重組位點特異重組(site spec

7、ific recombination)。n舉例：舉例： 噬菌體噬菌體DNA的整合的整合 細菌的特異位點重組細菌的特異位點重組如沙門氏菌如沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變 免疫球蛋白基因的重排以及轉(zhuǎn)座重組免疫球蛋白基因的重排以及轉(zhuǎn)座重組n作用：作用： 某些基因表達的調(diào)節(jié)某些基因表達的調(diào)節(jié) 發(fā)育過程中程序性發(fā)育過程中程序性DNA重排重排 有些病毒和質(zhì)粒有些病毒和質(zhì)粒DNA復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除目目 錄錄n大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移基因可以從

8、一個位置移動到另一位置。這些可移動的動的DNA序列包括序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子插入序列和轉(zhuǎn)座子(transposon, Tn)。由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排。由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)，又稱，又稱轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組(transpositional recombination)。目目 錄錄1.插入序列插入序列(insertion sequences, IS)組成：組成： 二個分離的、反向重復(fù)二個分離的、反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列序列（但側(cè)翼連接（但側(cè)翼連接有短的、不同的插入序列有短的、不同的插入序列的

9、的正向重復(fù)序列正向重復(fù)序列） 一個轉(zhuǎn)座酶（一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因編碼基因 （表達產(chǎn)物可引起轉(zhuǎn)座）（表達產(chǎn)物可引起轉(zhuǎn)座） IRTransposase GeneIR2.插入序列引起的轉(zhuǎn)座的發(fā)生形式：插入序列引起的轉(zhuǎn)座的發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition)： 插入序列從原位到新位。插入序列從原位到新位。復(fù)制性轉(zhuǎn)座復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)： 插入序列復(fù)制后，其中的一個復(fù)制本遷移到新位，另一個保留插入序列復(fù)制后，其中的一個復(fù)制本遷移到新位，另一個保留在原位。在原位。目目 錄錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(tr

10、ansposons) 可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。也就是一段可以發(fā)生轉(zhuǎn)座的也就是一段可以發(fā)生轉(zhuǎn)座的DNA。轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶編碼基因轉(zhuǎn)座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因（與插入序列不同）（與插入序列不同）IRIRTransposase Gene有用基有用基因因目目 錄錄 Recombinant DNA Technology第二十四章第二十四章目目 錄錄 克隆克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。克隆化克隆化(cl

11、oning)獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。技術(shù)水平：技術(shù)水平： 分子克隆分子克隆(molecular clone)/DNA 克隆克隆(DNA cloning) 細胞克隆細胞克隆 器官（或組織）克隆器官（或組織）克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克?。▌游锘蛑参铮┠磕?錄錄 又稱分子克隆又稱分子克隆(molecular cloning)或或DNA克隆克隆(DNA cloning)或基因克隆或基因克隆(gene cloning) 技術(shù)，是指技術(shù)，是指在在體外體外利用利用酶學(xué)方法酶學(xué)方法將將目的目的DNA片段片段與能自主復(fù)制與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫的遺傳元件（又叫

12、載體載體）連接，形成）連接，形成重組重組DNA分子分子，進而在進而在受體細胞中復(fù)制、擴增受體細胞中復(fù)制、擴增，從而獲得，從而獲得單一單一DNA分子的大量拷貝分子的大量拷貝。 克隆目的基因后，針對該基因進行特定蛋白質(zhì)或克隆目的基因后，針對該基因進行特定蛋白質(zhì)或多肽制備以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的多肽制備以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為工作統(tǒng)稱為基因工程基因工程(genetic engineering)。目目 錄錄第第 一一 節(jié)節(jié)重組重組DNA技術(shù)中常用的技術(shù)中常用的工具酶工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Tec

13、hnology目目 錄錄定義定義:限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)簡稱限簡稱限制性內(nèi)切酶或限制酶，是一類制性內(nèi)切酶或限制酶，是一類核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶，能，能識別識別雙鏈雙鏈DNA分子分子內(nèi)部內(nèi)部的特異位點并的特異位點并裂解磷酸二酯鍵裂解磷酸二酯鍵，大多數(shù)來自細菌。，大多數(shù)來自細菌。根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為性可分為、型三大類。型三大類。其中其中、型為復(fù)合功能酶，同時具有限制和型為復(fù)合功能酶，同時具有限制和DNA修飾修飾2種作用，特異性不強。種作用，特異性不

14、強。通常所說的限制酶指通常所說的限制酶指型內(nèi)切酶型內(nèi)切酶。目目 錄錄第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第四個字母（有時無）代表株（可大寫或小寫）；第四個字母（有時無）代表株（可大寫或小寫）；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶目目 錄錄1. 具有具有特定的識別和切割位點特定的識別和切割

15、位點（通常為（通常為6/4堿基序列，也有堿基序列，也有8以上的）以上的） 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識別位點識別位點限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識別位點識別位點Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGCCGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II II型限制性內(nèi)切酶的識別位點舉例（型限制性內(nèi)切酶的識別位點舉例（示切割位點）示切割位點） 目目 錄錄2. 識別的核苷酸序列通常為

16、識別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 又稱又稱反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列(inverted repeat)：是指在兩條：是指在兩條核苷酸鏈中，從核苷酸鏈中，從53方向的核苷酸序列完全一樣。方向的核苷酸序列完全一樣。目目 錄錄Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG鈍性末端鈍性末端/平端平端黏性末端黏性末端/黏端黏端3. 切割雙鏈切割雙鏈DNA分子后產(chǎn)生分子后產(chǎn)生黏性或鈍性末端黏性或鈍性末端(sticky end) (blunt end) 錯位切割錯位切割（多數(shù)）（多數(shù)）目目 錄錄同尾酶同尾酶(i

17、socaudarner) 有些限制性內(nèi)切酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同雖然識別序列不完全相同，但切，但切割割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。這兩個相同的黏端稱為酶。這兩個相同的黏端稱為配伍末端配伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 配伍末端可以共價連接，但連接后的序列有時就不配伍末端可以共價連接，但連接后的序列有時就不能被能被2個同尾酶中的任何一個識別

18、、切割了個同尾酶中的任何一個識別、切割了目目 錄錄GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG GXmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSma能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同的兩種酶互稱的兩種酶互稱同識異切酶同識異切酶(isoschizomer)或或同裂酶同裂酶。 5. 不同的酶可以識別同一個序列不同的酶可以識別同一個序列 為為DNA操作增加了酶的選擇余地操作增加了酶的選擇余地目目 錄錄6. 切割特性會

19、受其他因素的影響切割特性會受其他因素的影響限制性內(nèi)切酶通常不能切割在識別位點內(nèi)有特異堿限制性內(nèi)切酶通常不能切割在識別位點內(nèi)有特異堿基基甲基化甲基化的序列。的序列。緩沖液緩沖液或或環(huán)境溫度環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。也會影響一些酶的特異性。例如，例如，EcoR I在正常情況下識別在正常情況下識別“-GAATTC-”序序列，但在甘油濃度大于列，但在甘油濃度大于5%（v/v）或反應(yīng)溫度較低）或反應(yīng)溫度較低時識別序列可變?yōu)闀r識別序列可變?yōu)椤?AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧嘧啶嘧啶啶嘧啶-”，這種現(xiàn)象稱為，這種現(xiàn)象稱為星號活性星號活性(star activity)，以以EcoR I*表示

20、。表示。目目 錄錄 DNA連接酶連接酶(DNA ligase)：催化兩個相鄰的：催化兩個相鄰的3-OH和和5-磷酸基團形成磷酸基團形成3，5-磷酸二酯鍵，從而使磷酸二酯鍵，從而使DNA片段或單鏈片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來。斷裂形成的缺口連接起來。連接酶的作用機制連接酶的作用機制反應(yīng)中，反應(yīng)中，AMP加到加到5-磷酸基團上，磷酸基團上，AMP隨后受到隨后受到3-OH的攻擊而被替換。的攻擊而被替換。目目 錄錄 1. 大腸桿菌染色體編碼的大腸桿菌染色體編碼的 DNA連接酶連接酶 需需NAD+作為輔因子，連平端效率低作為輔因子，連平端效率低 2. T4噬菌體噬菌體DNA編碼的編碼的T4 DNA連

21、接酶（更常用）連接酶（更常用） 需需ATP作為輔因子，能連平端、黏端作為輔因子，能連平端、黏端 DNA連接酶的來源連接酶的來源目目 錄錄（一）（一） 堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基團團（二）反轉(zhuǎn)錄酶以（二）反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成為模板合成cDNA（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加末端加尾以構(gòu)成尾以構(gòu)成黏黏性末端性末端 （四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性（六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于

22、PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5羥基末端磷羥基末端磷酸化酸化目目 錄錄 來自于大腸桿菌（來自于大腸桿菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛腸（或小牛腸（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于）。用于脫去脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團，使末端的磷酸基團，使5 -P成為成為5 -OH，該，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。過程稱核酸分子的脫磷酸作用?？梢苑乐馆d體的自連接可以防止載體的自連接，提高，提高載體與載體與DNA片段的重組效率。片段的重組效率。P5OH3OH3

23、P5OH5OH3OH3OH5更常用更常用目目 錄錄反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 反轉(zhuǎn)錄酶催化的反轉(zhuǎn)錄酶催化的cDNA合成合成RNARNA53AAAAAAAAAAAATTTTTT53cDNAcDNA隨機引物隨機引物Oligo-dT合成方向合成方向53，無無35外切酶活性外切酶活性，常用，常用于于構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫文庫和和RT-PCR。目目 錄錄 5 35533 53OHGGG GGdGTP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶簡稱末端轉(zhuǎn)移酶，將單獨的一種簡稱末端轉(zhuǎn)移酶，將單獨的一種dNTP連續(xù)地加到連續(xù)地加到DNA分子分子的的3-OH上，產(chǎn)生同聚物尾上，產(chǎn)生同聚物尾(homop

24、olymer tail)。不需模板。不需模板。常用于常用于載體和插入片段之間的互補連接。目目 錄錄 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I(DNA polymerase I)是基因工是基因工程中常用的程中常用的DNA聚合酶。其除具有聚合酶。其除具有53聚合酶活性外，聚合酶活性外，還有還有35及及53核酸外切酶活性。因其核酸外切酶活性。因其具有具有53核核酸外切酶活性酸外切酶活性而而常用于常用于DNA探針的缺口平移法探針的缺口平移法(nick translation)標記。標記。 目目 錄錄 DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段(large fragment of DNA polymerase I)為

25、為DNA聚合酶聚合酶I用枯草桿菌蛋白酶用枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)裂解后產(chǎn)生的大片裂解后產(chǎn)生的大片段，這個片段也稱為段，這個片段也稱為Klenow片段片段(Klenow fragment)。其保留了其保留了53聚合酶活性及聚合酶活性及3 5外切酶活性，失去了外切酶活性，失去了5 3外切酶活外切酶活性。性。它具有的它具有的35外切酶活性能保證外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準確性，即復(fù)制的準確性，即把把DNA合成過程中錯配的核苷酸去除，再把正確的核苷酸接上合成過程中錯配的核苷酸去除，再把正確的核苷酸接上去（該活性稱為校對活性）。去（該活性稱為校對活性）。 Klenow片段的主要用途有：片

26、段的主要用途有： 補齊雙鏈補齊雙鏈DNA的的3末端，末端，使其轉(zhuǎn)變成平端；或通過補齊使其轉(zhuǎn)變成平端；或通過補齊3端而使端而使3末端標記；末端標記； 在在cDNA克隆中，用于第二股鏈的合成；克隆中，用于第二股鏈的合成； 用于用于DNA序列分析。序列分析。目目 錄錄將黏端轉(zhuǎn)變成平端將黏端轉(zhuǎn)變成平端GC T T A A OH 35 35GA A T TC T T A A5335 對對5-黏端片段黏端片段，利用大腸桿菌，利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段，在片段，在3-OH端延伸，可填平末端的凹陷并端延伸，可填平末端的凹陷并將其轉(zhuǎn)變成平端將其轉(zhuǎn)變成平端。DNADNA聚合酶聚合酶 Ec

27、oR目目 錄錄將黏端轉(zhuǎn)變成平端將黏端轉(zhuǎn)變成平端C T G C AG 5 35CG533 對對3黏端的片段黏端的片段，應(yīng)用如，應(yīng)用如T4 DNA聚合酶的聚合酶的35的核酸的核酸外切酶外切酶活性可切去未配對的序列，將其轉(zhuǎn)變成平端?；钚钥汕腥ノ磁鋵Φ男蛄校瑢⑵滢D(zhuǎn)變成平端。核酸外切酶核酸外切酶 PstPst 53目目 錄錄 Taq DNA聚合酶具有良好的聚合酶具有良好的聚合活性聚合活性和和熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定性性，常用于常用于PCR。該酶具有。該酶具有53聚合酶活性聚合酶活性及及53外切酶活性外切酶活性，但，但沒有沒有35外切酶活性外切酶活性，因而，因而無無35校對活性校對活性，故在，故在PCR反應(yīng)中如果發(fā)生

28、堿基反應(yīng)中如果發(fā)生堿基錯配，該酶沒有校正功能。針對此不足，目前研發(fā)錯配，該酶沒有校正功能。針對此不足，目前研發(fā)出多種高保真耐高溫出多種高保真耐高溫DNA聚合酶，大大降低了聚合酶，大大降低了PCR過程中的堿基錯配率。過程中的堿基錯配率。 另外，另外，Taq DNA聚合酶具有聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶作用，作用，能在所合成能在所合成DNA鏈的鏈的3末端加上一個單獨的腺苷酸末端加上一個單獨的腺苷酸殘基（殘基（A）。這樣的）。這樣的PCR產(chǎn)物可直接與帶有產(chǎn)物可直接與帶有3-T的線的線性化載體（性化載體（T載體）連接（即載體）連接（即T-A克隆克隆）。）。目目 錄錄 常用的是常用的是T4多核苷酸激酶

29、多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)，該酶含，該酶含5多核苷酸激酶和多核苷酸激酶和3磷酸酶活性，能磷酸酶活性，能催化催化ATP的的-位磷酸向位磷酸向DNA和和RNA的的5-羥基轉(zhuǎn)移。羥基轉(zhuǎn)移。 該酶常用于：該酶常用于： DNA或或RNA的的5末端標記；末端標記； 使沒有使沒有5-末端磷酸的末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供連接和片段磷酸化，以供連接和克隆之用?？寺≈?。目目 錄錄總結(jié)：重組總結(jié)：重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DN

30、A中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA；替代；替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標記或進行填補，標記或DNA序列序列分析分析末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 在在3 羥基末端進行同聚物加尾羥基末端進行同聚物加尾DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接；缺口平移制作高比活性探分子或片段連接；缺口平移制作高比活性探針；針；DNA序列分析；填補序列分析；填補3 末

31、端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚聚合、合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第第二鏈合成，雙鏈二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標記等末端標記等Taq DNA聚合酶聚合酶 常用于常用于PCR；產(chǎn)物的；產(chǎn)物的3末端帶有末端帶有A，可用于，可用于T-A克隆克隆多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針目目 錄錄第二節(jié)第二節(jié) 目的目的DNA的獲取的獲取Preparation of Interested DNA

32、目目 錄錄要求：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列（加以推測）物的氨基酸序列（加以推測）應(yīng)用：一般用于應(yīng)用：一般用于小分子肽類基因小分子肽類基因的合成的合成方法：先合成互補單鏈，經(jīng)退火形成雙鏈，方法：先合成互補單鏈，經(jīng)退火形成雙鏈，然后克隆于載體然后克隆于載體DNA目目 錄錄 第一步：構(gòu)建第一步：構(gòu)建(genomic DNA library)，是指包含某一個生物細胞或組是指包含某一個生物細胞或組織全部基因組織全部基因組DNA序列的隨機克隆群體，以序列的隨機克隆群體，以DNA片段的形式貯存了所有的基因組片段的形式貯存了所有的基因組DNA信息信息。 第

33、二步：篩選含有目的基因的克隆。第二步：篩選含有目的基因的克隆。 目目 錄錄分離組織或細胞染色體分離組織或細胞染色體DNA大小不等基因片段大小不等基因片段克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子（多個拷含重組分子（多個拷貝）的轉(zhuǎn)化菌貝）的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶或機械剪切或機械剪切受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫這些這些菌稱為了基因組菌稱為了基因組DNA的載的載體，而不是單獨的存在體，而不是單獨的存在1個個個個DNA片段。從文庫中鑒片段。從文庫中鑒定帶有目的定帶有目的DNA的方法：的方法：菌落菌落/噬斑原位雜交噬斑原位雜交。* 構(gòu)建基因組構(gòu)建基因組DNA文庫的簡要過程文庫的簡

34、要過程目目 錄錄 第一步：構(gòu)建第一步：構(gòu)建，即包含，即包含在一定條件下所表達的在一定條件下所表達的全部全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存片段的形式貯存了全部的基因表達信息。了全部的基因表達信息。 第二步：篩選含有目的第二步：篩選含有目的的克隆。的克隆。 目目 錄錄cDNA文庫中文庫中篩選目的基篩選目的基因的方法：因的方法：1.菌落菌落/噬斑噬斑原位雜交原位雜交2.親和篩選親和篩選法（針對法（針對cDNA表達表達文庫）文庫）目目 錄錄前提：前提：已知待擴增目的基因已知待擴增目的基因或或DNA片段兩端的序片段兩端的序列

35、，并根據(jù)該序列合成適當引物。列，并根據(jù)該序列合成適當引物。聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是根據(jù)是根據(jù)DNA復(fù)制的原理，在體外利用酶促反應(yīng)獲復(fù)制的原理，在體外利用酶促反應(yīng)獲得特異性序列的基因組得特異性序列的基因組DNA或或cDNA的專門技術(shù)。的專門技術(shù)。PCR的反應(yīng)體系：的反應(yīng)體系：模板模板DNA、特異性引物、特異性引物、DNA聚合酶、聚合酶、dNTP、含鎂離子的緩沖液含鎂離子的緩沖液目目 錄錄PCR的過程的過程 變性變性(Denaturing)：經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至95使模板使模板DNA 從從 dsDNA 變成變成ssDNA 退火退火(

36、Annealing)：將溫度下降到：將溫度下降到50左右，使引物與模板左右，使引物與模板DNA雜交雜交 延伸延伸(Extension)：將溫度升至：將溫度升至72，DNA 合成合成 上述上述3個步驟為一個循環(huán)，循環(huán)擴增個步驟為一個循環(huán)，循環(huán)擴增目目 錄錄利用酵母單雜交系統(tǒng)可克隆利用酵母單雜交系統(tǒng)可克隆DNA結(jié)合蛋結(jié)合蛋白的基因白的基因利用酵母雙雜交系統(tǒng)可克隆特異性相互利用酵母雙雜交系統(tǒng)可克隆特異性相互作用蛋白質(zhì)的基因作用蛋白質(zhì)的基因目目 錄錄p化學(xué)合成法可直接合成目的基因化學(xué)合成法可直接合成目的基因（最常用最常用）p從基因組從基因組DNA文庫中獲取目的基因文庫中獲取目的基因p從從cDNA文庫中

37、獲取目的基因文庫中獲取目的基因p經(jīng)經(jīng)PCR獲取目的基因獲取目的基因（已知序列的情況下，獲已知序列的情況下，獲得目的基因最簡便的方法得目的基因最簡便的方法）p通過特異性雜交系統(tǒng)獲取某些轉(zhuǎn)錄因子的通過特異性雜交系統(tǒng)獲取某些轉(zhuǎn)錄因子的編碼編碼DNA目目 錄錄第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)中的技術(shù)中的DNA載體載體DNA Vectors in Recombinant DNA Technology 目目 錄錄載體載體(vector) 是攜帶目的外源是攜帶目的外源DNA，實現(xiàn)外源，實現(xiàn)外源DNA在受體細胞中在受體細胞中的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些D

38、NA分子分子。按功能分按功能分克隆載體克隆載體(cloning vector)表達載體表達載體(expression vector)按基本元件的來源不同分按基本元件的來源不同分質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體黏粒載體黏粒載體病毒載體病毒載體人工染色體載體等人工染色體載體等目目 錄錄克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列克隆和擴增而序列克隆和擴增而特意設(shè)計的載體稱為特意設(shè)計的載體稱為克隆載體?？寺≥d體。表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列表達而特意設(shè)序列表達而特意設(shè)計的載體稱為計的載體稱

39、為表達載體。表達載體。有的載體兼有有的載體兼有2種功能種功能。目目 錄錄p至少有一個至少有一個復(fù)制起點復(fù)制起點(origin of replication, ori)p至少有一個至少有一個選擇性標志選擇性標志(selection marker)區(qū)區(qū)分含載體的細胞和不含載體的細胞分含載體的細胞和不含載體的細胞p有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點：稱為有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點：稱為多克隆多克隆位點位點(multiple cloning sites，MCS)供外源基供外源基因插入時選擇因插入時選擇p應(yīng)有較高的應(yīng)有較高的拷貝數(shù)拷貝數(shù)單個細菌中某質(zhì)粒的分子單個細菌中某質(zhì)粒的分子數(shù)數(shù)目目 錄錄1. 質(zhì)粒

40、質(zhì)粒 (plasmid) 廣泛存在于細菌、酵廣泛存在于細菌、酵母在內(nèi)的多種微生物中的、母在內(nèi)的多種微生物中的、獨立于宿主染色體之外的、獨立于宿主染色體之外的、能自主復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的能自主復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的DNA分子，通常為雙鏈環(huán)分子，通常為雙鏈環(huán)狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。常帶有狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。常帶有抗性基因，利于篩選?？剐曰颍诤Y選。特點特點：能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些：能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息遺傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 目目 錄錄嚴緊型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒：質(zhì)粒與細菌染色體同步復(fù)制，處于：質(zhì)粒與細菌染色體同步復(fù)制，處于嚴密控制之下

41、，其拷貝數(shù)較低。嚴密控制之下，其拷貝數(shù)較低。松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒：質(zhì)粒的復(fù)制快于細菌染色體復(fù)制：質(zhì)粒的復(fù)制快于細菌染色體復(fù)制（即質(zhì)粒復(fù)制不受嚴格控制），其拷貝數(shù)很高。（即質(zhì)粒復(fù)制不受嚴格控制），其拷貝數(shù)很高。重組重組DNA技術(shù)中使用的質(zhì)粒通常是技術(shù)中使用的質(zhì)粒通常是松弛型松弛型。不同的質(zhì)粒必須兼容才能共存于同一細胞中（原不同的質(zhì)粒必須兼容才能共存于同一細胞中（原核細胞質(zhì)粒不兼容性）核細胞質(zhì)粒不兼容性），這對復(fù)合轉(zhuǎn)染（或轉(zhuǎn)化），這對復(fù)合轉(zhuǎn)染（或轉(zhuǎn)化）有參考價值。有參考價值。質(zhì)粒載體通常所能容納的外源質(zhì)粒載體通常所能容納的外源DNA長度在長度在10kb以以內(nèi)（內(nèi)（比噬菌體小比噬菌體小），外源），外

42、源DNA片段越長，質(zhì)粒越片段越長，質(zhì)粒越不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。 目目 錄錄（1）噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（系列（插入型插入型，適用于，適用于cDNA克隆）克?。〦MBL系列（系列（置換型置換型，適用于基因組，適用于基因組DNA克?。┛寺。ヽos位點位點：噬菌體噬菌體DNA為為線性雙鏈分子線性雙鏈分子，兩端各有一條，兩端各有一條由由12個堿基組成、彼此完全互補且個堿基組成、彼此完全互補且5單鏈突出的序列單鏈突出的序列（即粘性末端）。感染時，憑借這一位點環(huán)化成環(huán)狀雙（即粘性末端）。感染時，憑借這一位點環(huán)化成環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)。鏈結(jié)構(gòu)。2. 噬菌體噬菌體(phage)DNA （2）M13噬菌

43、體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）單鏈閉環(huán)單鏈閉環(huán)狀分子狀分子目目 錄錄3. 穿梭載體穿梭載體(shuttle vector) 人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外源源DNA序列在不同種類宿主細胞中復(fù)制、擴增。序列在不同種類宿主細胞中復(fù)制、擴增。目目 錄錄u 表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基因的載體因的載體u 依據(jù)其宿主細胞的不同可分為依據(jù)其宿主細胞的不同可分為: 原核表達載體原核表達載體(prokaryotic expression vector) 真核表達載體真核表達載體(euk

44、aryotic expression vector) 目目 錄錄 從克隆載體發(fā)展而來，其從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外除了具備克隆載體的一般特點外，還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動子、核糖啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。目前應(yīng)用最廣泛的原核表達載。目前應(yīng)用最廣泛的原核表達載體是體是大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體。原核表達載體的基本組成如下：。原核表達載體的基本組成如下：R：調(diào)節(jié)序列；：調(diào)節(jié)序列； P：啟動子；：啟動子； SD：SD序列；序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列：轉(zhuǎn)錄終止序列大腸桿菌表

45、達載體大腸桿菌表達載體目目 錄錄lLac啟動子（乳糖啟動子）啟動子（乳糖啟動子） lTrp啟動子（色氨酸啟動子）啟動子（色氨酸啟動子）lTac啟動子（乳糖和色氨酸的雜合啟動子）啟動子（乳糖和色氨酸的雜合啟動子） lPL和和PR啟動子（啟動子（噬菌體的左向和右向啟動子，噬菌體的左向和右向啟動子，溫溫度誘導(dǎo)型度誘導(dǎo)型） lT7啟動子啟動子1. 啟動子是啟動外源基因表達的必需元件，其能被啟動子是啟動外源基因表達的必需元件，其能被RNA聚合酶所識別。聚合酶所識別。目前原核表達載體常使用的啟動子有以下幾種目前原核表達載體常使用的啟動子有以下幾種 ：目目 錄錄2. SD序列提供核糖體結(jié)合位點序列提供核糖體

46、結(jié)合位點3. 轉(zhuǎn)錄終止序列轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使有助于使RNA聚合酶重點轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，聚合酶重點轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，控制所轉(zhuǎn)錄控制所轉(zhuǎn)錄RNA的長度，提高的長度，提高RNA穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。 位于啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止序列可阻止其他啟位于啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止序列可阻止其他啟動子的通讀，降低本底；位于多克隆位點下游的轉(zhuǎn)動子的通讀，降低本底；位于多克隆位點下游的轉(zhuǎn)錄終止序列可防止因外源基因表達而干擾載體的穩(wěn)錄終止序列可防止因外源基因表達而干擾載體的穩(wěn)定性。定性。目目 錄錄4. 幾種常見的原核表達載體各有特點幾種常見的原核表達載體各有特點 依據(jù)表達目的蛋白的方式，可將原核表達載體依據(jù)表達目的蛋白的方

47、式，可將原核表達載體分為分為 （1）非融合型表達載體）非融合型表達載體 （2）融合型表達載體）融合型表達載體 （3）分泌型表達載體）分泌型表達載體 目目 錄錄（1）非融合型表達載體用于表達非融合蛋白）非融合型表達載體用于表達非融合蛋白 非融合蛋白是指不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起進非融合蛋白是指不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起進行表達的蛋白。表達該類蛋白的載體稱為非融合型表達載體。行表達的蛋白。表達該類蛋白的載體稱為非融合型表達載體。如如pKK223-3（使用使用tac啟動子啟動子）。（2）融合型表達載體用于表達融合蛋白）融合型表達載體用于表達融合蛋白 將一段特殊的蛋白質(zhì)（或短肽）的基因

48、構(gòu)建入載體，使之將一段特殊的蛋白質(zhì)（或短肽）的基因構(gòu)建入載體，使之與目的蛋白融合表達可形成與目的蛋白融合表達可形成融合蛋白融合蛋白(fusion protein)。表達該類。表達該類蛋白的載體稱為融合型表達載體，如蛋白的載體稱為融合型表達載體，如pGEX系統(tǒng)（系統(tǒng)（使用使用tac啟動啟動子子）。（3）分泌型表達載體用于外源基因的分泌表達）分泌型表達載體用于外源基因的分泌表達 優(yōu)點是能把在受體細菌內(nèi)表達的外源蛋白有效地分泌到周優(yōu)點是能把在受體細菌內(nèi)表達的外源蛋白有效地分泌到周質(zhì)腔，甚至穿過細胞外膜進入培養(yǎng)基中。需含有質(zhì)腔，甚至穿過細胞外膜進入培養(yǎng)基中。需含有編碼信號肽的編碼信號肽的序列序列（通常

49、置于（通常置于SD序列下游）。序列下游）。分泌型載體既可用于非融合蛋分泌型載體既可用于非融合蛋白的表達，也可用于融合蛋白的表達白的表達，也可用于融合蛋白的表達。pIN系列載體是較常用系列載體是較常用的分泌型表達載體的分泌型表達載體 目目 錄錄 真核表達載體也是從克隆載體發(fā)展而來，故包括必不真核表達載體也是從克隆載體發(fā)展而來，故包括必不可少的原核序列，如大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點、可少的原核序列，如大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達載體中還具有自身的特點：真核表達載體中還具有自身的特點： 真核表達調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、

50、轉(zhuǎn)錄終真核表達調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、止序列、poly A 加尾信號等加尾信號等 真核細胞復(fù)制起始序列真核細胞復(fù)制起始序列 真核細胞藥物抗性基因真核細胞藥物抗性基因用于轉(zhuǎn)入真核細胞后進用于轉(zhuǎn)入真核細胞后進行陽性克隆的篩選行陽性克隆的篩選目目 錄錄OriPro：原核復(fù)制起始序列；：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；：啟動子；MCS：多克?。憾嗫寺∥稽c；位點；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。：真核復(fù)制起始序列。注：不是所有真核表達載體都有整合序列注：不是所有真核表達載體都有整合序列 真核表達載體的基本組成真核表達載體的基本組成 目目 錄錄真核啟動

51、子和增強子在不同類型細胞中的活性差別很大。真核啟動子和增強子在不同類型細胞中的活性差別很大。Rous肉瘤病毒基因組長末端重復(fù)序列肉瘤病毒基因組長末端重復(fù)序列(long terminal repeats，LTR)、SV40病毒早期基因的啟動子和增強子病毒早期基因的啟動子和增強子、人類巨細胞病毒人類巨細胞病毒(CMV)啟動子啟動子等，可在廣泛的宿主細胞中起作用，故在真核表達等，可在廣泛的宿主細胞中起作用，故在真核表達載體中被普遍使用。載體中被普遍使用。 真核表達載體帶有的真核表達載體帶有的poly A 加尾信號可保證新轉(zhuǎn)錄的加尾信號可保證新轉(zhuǎn)錄的mRNA能有效地加上能有效地加上poly A。酵母表

52、達載體酵母表達載體昆蟲表達載體昆蟲表達載體哺乳類細胞表達載體哺乳類細胞表達載體根據(jù)真核宿主細胞的不同，真核表達載體可主要根據(jù)真核宿主細胞的不同，真核表達載體可主要分為分為 ：目目 錄錄p 黏粒黏粒(cosmid)：又稱粘性質(zhì)?；蜓b配型質(zhì)粒，是由：又稱粘性質(zhì)?；蜓b配型質(zhì)粒，是由DNA的的cos區(qū)區(qū)與與質(zhì)粒質(zhì)粒重新構(gòu)建而成的雜合雙鏈環(huán)狀重新構(gòu)建而成的雜合雙鏈環(huán)狀DNA載體。載體。p 特點：特點： 含有質(zhì)粒的抗性標記基因及復(fù)制起點和多克隆位含有質(zhì)粒的抗性標記基因及復(fù)制起點和多克隆位點，點，可按質(zhì)粒的方式在宿主菌中進行自主復(fù)制可按質(zhì)粒的方式在宿主菌中進行自主復(fù)制； 帶有帶有噬菌體噬菌體DNA的的cos

53、序列，序列，可像可像噬菌體噬菌體DNA一樣進行體外包一樣進行體外包裝裝； 黏粒本身較小，通常只有幾黏粒本身較小，通常只有幾kb，但，但能容納高達能容納高達50 kb的外源的外源DNA片段片段； 非重組體黏粒很小，故不能在體外非重組體黏粒很小，故不能在體外進行包裝，所以有利于后續(xù)陽性克隆的篩選；進行包裝，所以有利于后續(xù)陽性克隆的篩選； 黏粒因缺黏粒因缺乏全部乏全部基因，不會產(chǎn)生噬斑，但在選擇培養(yǎng)基平板上形成基因，不會產(chǎn)生噬斑，但在選擇培養(yǎng)基平板上形成菌落，這一點也與質(zhì)粒載體一致。菌落，這一點也與質(zhì)粒載體一致。目目 錄錄p細菌人工染色體細菌人工染色體(bacterial artificial ch

54、romosome, BAC)基于基于F質(zhì)粒構(gòu)建而成。質(zhì)粒構(gòu)建而成。BAC能容納高達能容納高達400 kb(一般為一般為50 kb250 kb)的外源的外源DNA。p酵母人工染色體酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)載體能攜帶更大的載體能攜帶更大的DNA片段，其由酵母線片段，其由酵母線性質(zhì)粒性質(zhì)粒(Ylp)發(fā)展而來，含有染色體的兩個端粒片發(fā)展而來，含有染色體的兩個端粒片段，能復(fù)制出線性段，能復(fù)制出線性DNA，其克隆容量可高達其克隆容量可高達3 Mb(一般為一般為500 kb2Mb)（最高！）（最高?。?。利用重組。利用重組線性線性DNA轉(zhuǎn)化細胞，可建成

55、包含人全部基因組轉(zhuǎn)化細胞，可建成包含人全部基因組DNA的巨型的巨型YAC文庫。文庫。目目 錄錄p啟動子探針型載體（即通常所說的報告基因載體）是啟動子探針型載體（即通常所說的報告基因載體）是一種快速分離和鑒定基因啟動子的工具型載體。一種快速分離和鑒定基因啟動子的工具型載體。p把某種組織特異性的調(diào)控序列（如啟動子）構(gòu)建于把某種組織特異性的調(diào)控序列（如啟動子）構(gòu)建于表達載體，使外源基因的表達嚴格受控于該調(diào)控序表達載體，使外源基因的表達嚴格受控于該調(diào)控序列，就形成了組織特異性表達載體。列，就形成了組織特異性表達載體。目目 錄錄p一般的表達載體只有一個啟動子，為了特殊一般的表達載體只有一個啟動子，為了特

56、殊需要，可給表達載體組裝兩個啟動子，構(gòu)成需要，可給表達載體組裝兩個啟動子，構(gòu)成雙啟動子表達載體，雙啟動子表達載體，旨在方便地研究不同條旨在方便地研究不同條件下的基因表達情況或分別啟動不同基因的件下的基因表達情況或分別啟動不同基因的表達。表達。p有時為了提高目的基因的表達水平，可將兩有時為了提高目的基因的表達水平，可將兩個或兩個以上的相同啟動子串聯(lián)在一起，個或兩個以上的相同啟動子串聯(lián)在一起，構(gòu)構(gòu)成串聯(lián)啟動子表達載體。成串聯(lián)啟動子表達載體。目目 錄錄p有些表達載體不用于表達蛋白質(zhì)，而是用于表有些表達載體不用于表達蛋白質(zhì)，而是用于表達小分子干擾達小分子干擾RNA(small interfering

57、RNA, siRNA)或微小或微小RNA(micro RNA, miRNA)等。等。p例如，目前，用于表達例如，目前，用于表達siRNA的載體已有多種的載體已有多種（如（如pSilencer2.1-U6 neo，mU6pro等）。等）。 目目 錄錄p載體上的載體上的標志標志(marker)：通常用于重組子或陽性克隆的：通常用于重組子或陽性克隆的篩選、鑒定。篩選、鑒定。p常見的標志有：常見的標志有： 抗生素抗性基因抗生素抗性基因 a.用于細菌重組子篩選的抗生素抗性基因用于細菌重組子篩選的抗生素抗性基因 b.用于哺乳類細胞陽性克隆篩選的抗生素抗性基因用于哺乳類細胞陽性克隆篩選的抗生素抗性基因 酶的

58、編碼基因酶的編碼基因 營養(yǎng)缺陷選擇標志營養(yǎng)缺陷選擇標志p標簽標簽(tag)：其編碼序列通常構(gòu)建于表達載體，與目的：其編碼序列通常構(gòu)建于表達載體，與目的基因位于同一閱讀框內(nèi)，這樣就可使所表達的蛋白上基因位于同一閱讀框內(nèi)，這樣就可使所表達的蛋白上帶上標簽肽。帶上標簽肽。p標簽肽常用于表達產(chǎn)物的分離、純化與鑒定。標簽肽常用于表達產(chǎn)物的分離、純化與鑒定。目目 錄錄目目 錄錄 目的目的DNA的分離獲?。ǚ郑┑姆蛛x獲取（分） 載體的選擇與準備（擇）載體的選擇與準備（擇） 目的目的DNA與載體連接（接）與載體連接（接） 重組重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)入受體細胞（轉(zhuǎn)） 重組體的篩選與鑒定（篩）重組體的篩選

59、與鑒定（篩）目目 錄錄pDNA克隆的第一步是分離獲取目的克隆的第一步是分離獲取目的DNA。p目的目的DNA的來源有多種，包括基因組的來源有多種，包括基因組DNA、經(jīng)經(jīng)mRNA反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄的cDNA、PCR擴增產(chǎn)物、化擴增產(chǎn)物、化學(xué)合成法獲得的學(xué)合成法獲得的DNA等。等。目目 錄錄p進行進行DNA克隆的目的主要有二：克隆的目的主要有二： 獲得目的獲得目的DNA片段；片段； 獲得目的獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)片段所編碼的蛋白質(zhì)p針對第一種目的，通常選用克隆載體；針對第二針對第一種目的，通常選用克隆載體；針對第二種目的，需選用表達載體種目的，需選用表達載體p選擇載體時，還要考慮目的選擇載體時

60、，還要考慮目的DNA的大小、受體細的大小、受體細胞的種類和來源等因素胞的種類和來源等因素p選擇載體時還需注意載體內(nèi)應(yīng)有適宜的多克隆位選擇載體時還需注意載體內(nèi)應(yīng)有適宜的多克隆位點點目目 錄錄不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞載體載體插入插入DNA片段片段宿主細胞宿主細胞質(zhì)粒質(zhì)粒510 kb（最（最?。┬。┘毦?，酵母細菌，酵母噬菌體載體噬菌體載體20 kb細菌細菌黏粒黏粒50 kb細菌細菌BAC400 kb細菌細菌YAC3Mb（最大）（最大） 酵母酵母目目 錄錄 1. 單一相同黏端連接會產(chǎn)生載體自連單一相同黏端連接會產(chǎn)生載體自連如果目的基因如果目的基因序列兩端和線序列

61、兩端和線性化載體兩端性化載體兩端為同一限制性為同一限制性內(nèi)切酶切割所內(nèi)切酶切割所致，則產(chǎn)生的致，則產(chǎn)生的黏端完全相同。黏端完全相同。目目 錄錄單一相同黏端連接存在如下缺點：單一相同黏端連接存在如下缺點：l 容易出現(xiàn)載體自身環(huán)化容易出現(xiàn)載體自身環(huán)化l 目的目的DNA雙向插入載體（即正向和反向插入）雙向插入載體（即正向和反向插入）l 多拷貝現(xiàn)象多拷貝現(xiàn)象采用采用堿性磷酸酶堿性磷酸酶預(yù)處理線性化載體預(yù)處理線性化載體DNA，使之去，使之去磷酸化，可有效減少載體自身環(huán)化磷酸化，可有效減少載體自身環(huán)化目的目的DNA如果反向插入載體，雖不影響基因克隆，如果反向插入載體，雖不影響基因克隆，但卻影響外源基因的表

62、達但卻影響外源基因的表達 目目 錄錄GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶重組體重組體2. 定向克隆可有效避免載體自連和定向克隆可有效避免載體自連和DNA片段的反向插入片段的反向插入 定向克?。憾ㄏ蚩寺。簩⒋寺⒋寺NA分子和載體分子分子和載體分子采用采用2種限制性內(nèi)切種限制

63、性內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生酶切割，產(chǎn)生2種不種不同的黏端（也可以是同的黏端（也可以是黏端黏端+平端），可實平端），可實現(xiàn)外源現(xiàn)外源DNA片段的定片段的定向插入。向插入。目目 錄錄3. 通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接 人工接頭法人工接頭法同聚物加尾法同聚物加尾法PCR法法T-A克隆法克隆法 目目 錄錄目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連也有也有3種種結(jié)果結(jié)果目目 錄錄p為了提高連接效率，可采用提高連接酶為了提高連接效率，可采用提高連接酶用量、延長連接時間、降低反應(yīng)溫

64、度、用量、延長連接時間、降低反應(yīng)溫度、增加增加DNA片段與載體的摩爾比等措施片段與載體的摩爾比等措施p平端連接同樣存在載體自身環(huán)化、目的平端連接同樣存在載體自身環(huán)化、目的DNA雙向插入和多拷貝現(xiàn)象等缺點雙向插入和多拷貝現(xiàn)象等缺點目目 錄錄目目 錄錄導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式 將將質(zhì)粒質(zhì)粒/黏粒黏粒DNA直接導(dǎo)入細菌直接導(dǎo)入細菌/酵母細胞稱酵母細胞稱轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation) 需要感受態(tài)細胞需要感受態(tài)細胞(competent cell)化學(xué)誘導(dǎo)、電穿孔化學(xué)誘導(dǎo)、電穿孔 將將外源外源DNA導(dǎo)入真核細胞（酵母除外）或?qū)?dǎo)入真核細胞（酵母除外）或?qū)⑹删w噬菌體DNA導(dǎo)入細導(dǎo)入細菌稱菌稱轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(t

65、ransfection) 借助噬菌體或病毒顆粒借助噬菌體或病毒顆粒將外源將外源DNA導(dǎo)入宿主細胞稱導(dǎo)入宿主細胞稱感染感染(infection) 工程細胞工程細胞：理想的宿主細胞通常是：理想的宿主細胞通常是DNA和（或）蛋白和（或）蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)缺陷株，和（或）重組酶缺陷株。質(zhì)降解系統(tǒng)缺陷株，和（或）重組酶缺陷株。目目 錄錄篩選與鑒定程序主要包括：篩選與鑒定程序主要包括：先篩選出帶有先篩選出帶有載體的克??；然后篩選鑒定出帶有重組載載體的克?。蝗缓蠛Y選鑒定出帶有重組載體的克?。蛔詈蠛Y選鑒定出帶有目的體的克??；最后篩選鑒定出帶有目的DNA的克隆。的克隆。主要篩選和鑒定方法有遺傳標志篩選法、主要篩選和

66、鑒定方法有遺傳標志篩選法、序列特異性篩選法、親和篩選法等。序列特異性篩選法、親和篩選法等。目目 錄錄1. 利用利用抗生素抗性標志抗生素抗性標志可篩選出帶有載體的重可篩選出帶有載體的重組子組子 將含有某種抗生素抗性基因的載體轉(zhuǎn)將含有某種抗生素抗性基因的載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后，將細胞在含有相應(yīng)抗生素的入宿主細胞后，將細胞在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無載體轉(zhuǎn)入的細胞將被殺死，培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無載體轉(zhuǎn)入的細胞將被殺死，生長的細胞即是含有載體的細胞。生長的細胞即是含有載體的細胞。至于細胞至于細胞中的載體是否為含有目的中的載體是否為含有目的DNA的重組載體，的重組載體，尚需進一步鑒定。尚需進一步鑒定。目目 錄錄2. 利用利用標志補救標志補救篩選帶有載體的重組子篩選帶有載體的重組子 p標志補救標志補救(marker rescue)是指當載體上的標志基是指當載體上的標志基因在宿主細胞中表達時，通過互補宿主細胞的相因在宿主細胞中表達時，通過互補宿主細胞的相應(yīng)缺陷而使細胞在相應(yīng)選擇培養(yǎng)基中存活。利用應(yīng)缺陷而使細胞在相應(yīng)選擇培養(yǎng)基中存活。利用該策略可初步篩選帶有載體的重組子。該策略可初步篩選帶有載體的重組子。