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1、第五章 固定化酶及固定化技術 酶： 在水溶液中不穩(wěn)定 一次性使用 -難回收，難連續(xù)化生產(chǎn) 用于醫(yī)藥 /化學分析純度要求高 產(chǎn)物的分離純化困難 。 要求將酶變成不溶性 實際上將酶限制在一定空間 固定化 固定酶具有催化活性 1916年，美國科學家發(fā)現(xiàn) ， 酶和載體結(jié)合以后 ，在 水中呈不溶解狀態(tài)時， 仍 然具有生物催化活性 。 固定化酶可重復使用 操作穩(wěn)定性 酶在固定化后其活力可以緩慢釋放 , 酶的穩(wěn)定 性比天然狀態(tài)高 , 可重復多次使用 . 結(jié)果如圖所示 : 固定化酶的活力基本保持穩(wěn)定活力損失 15% ,由此可見該固定化酶具有良好的 操作穩(wěn)定性 例 :將 0.5g DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶
2、 與 10mL 1%殼聚糖 溶 液在 60 下連續(xù)反應 10 次每次反應時間為 6h 每次反應后 分別測定酶活力 一、固定化酶（ immobilized enzyme） 水溶性酶 水不溶性載體 固定化技術 水不溶性酶 （固定化酶） 什么是固定化酶？ 固定化酶：是指經(jīng)物理或化學方法處理，限制 在一定的空間范圍內(nèi)，可以反復使用而又能發(fā) 揮催化作用的酶制劑。 酶的固定化技術包括 吸附、交聯(lián)、共價結(jié)合（ 化學偶聯(lián)）及包埋 等多種方法。 與固定化酶技術相配套的 是酶生物反應器 同一般的化工容器一樣，需要對酶反應 器溫度和 pH等條件進行嚴格的控制；不 同的是，酶反應器必須進行無菌操作。 酶生物反應器 簡
3、 史 1916年， Nelson 載體的影響 ： 在固定化酶的周圍，形成了能對底物產(chǎn)生立體影響的 擴散層以及靜電的相互作用等引起的變化。 載體與酶的相互作用： 載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié) 構(gòu)、封閉酶活性部位等。 改變之一：構(gòu)象改變、立體屏蔽 構(gòu)象改變： 酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，導致 酶與底物結(jié)合能力或催化能力下降 立體屏蔽： 固定化后，使得酶的活性中心或 調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使得效 應物或者底物與酶的臨近或者接觸受 到干擾 改變之二：分配效應、擴散限制 微環(huán)境： 微環(huán)境 是指在固定化酶附近 的局部環(huán)境，而把主體溶液 稱為 宏觀環(huán)境 。 分配效應： 由于載體性質(zhì)，造成底
4、物和 效應物等在微觀體系和宏觀 體系之間的不等性分配，從 而影響酶促反應速度 擴散限制效應：底物、產(chǎn)物和效應物等，在環(huán) 境中的遷移運轉(zhuǎn)速度收到限制 DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶 :以 DEAE 纖維素為載體戊二醛為交聯(lián)劑 固定殼聚糖酶 改變之三：微擾 由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性 質(zhì) , 直接影響酶的催化能力或酶對效應物作出反應 的能力 1.固定化后酶活力的變化 固定化酶的活力在 多數(shù)情況 下比天然酶小，其專一性也能發(fā) 生改變。 例如： 用羧甲基纖維素載體固定的胰蛋白酶消化不同底物： 酪蛋白（ 高分子）原酶活力的 30% 苯酞精氨酸 -對硝基酰替苯胺 (低分子 )原酶活力的
5、80%。 一般認為高分子底物受到 空間位阻的影響 比低 分子底物大。 原因： 酶結(jié)構(gòu)的變化 空間位阻 不過，也有個別情況，酶在固定化后反 而比原酶活力提高，原因可能是偶聯(lián)過 程中酶得到化學修飾，或固定化過程提 高了酶的穩(wěn)定性。 Merlose曾選擇 50種固定化酶，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶 進行比較，發(fā)現(xiàn)： 30種酶穩(wěn)定性提高， 12種酶無變化， 8種酶穩(wěn)定性降低。 然而，由于目前尚未找到固定化方法與穩(wěn)定性之間規(guī)律性， 因此要預測怎樣才能提高穩(wěn)定性還有一定困難，但 大多數(shù)情 況下酶經(jīng)過固定化后穩(wěn)定性提高了 。 2.固定化對酶穩(wěn)定性的影響 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因 可能有以下幾點： 固定化后酶
6、分子與載體多點連接，可防止酶 分子伸展變形。 酶活力的緩慢釋放。 抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后， 由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑 制了降解 固定化青霉素?；?將酶于 0.05 mol L的 PBS（ pH 7.5）中分別在 不同溫度下保溫 6小時， 冷卻后測定酶活力。 固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu) 于自然酶 。 固定化酶的穩(wěn)定性變化 1.固定化酶； 2. 自然酶 a.熱穩(wěn)定性提高 測試結(jié)果 :5天后其活性仍可保留 96% . 例 :將 DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶 浸泡在 95%的 乙醇 中， 連續(xù) 5天測其催化活性 b.對有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高 提高固定化酶對各種有機溶
7、劑的穩(wěn)定性，使本來 不能在有機溶劑中進行的酶反應成為可能。 提高酶對某些抑制劑的穩(wěn)定性 可以預計，今后固定化酶在有機合成中應用會進 一步發(fā)展。 c.對 pH的穩(wěn)定性提高 青霉素?；冈诓煌?pH 值的緩沖液中，于 37 保溫 16 h測定酶活力。 固定化酶在 pH 5.5- 10.3活力穩(wěn)定； 游離酶則僅在 pH 7.0-9.0穩(wěn)定。 固定化酶的 pH穩(wěn)定性明 顯優(yōu)于游離酶。 d.對蛋白質(zhì)水解酶的抗性 固定化后載體與酶的緊密連接對其起一定保護作用 , 并在空間上阻礙酶與大分子物質(zhì)接近 , 從而降低了酶與 大分子物質(zhì)結(jié)合的幾率 ,防止酶被其他蛋白酶水解 . 此外： 有些固定化酶經(jīng)過貯藏，可以提高
8、其活性。 大多數(shù)酶經(jīng)固定化后提高了貯藏的穩(wěn)定性，如 固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在 4 下， 120天酶活力 無變化。 對操作穩(wěn)定性都有影響 如圖：固定化酶的最適 溫度為 60 C ，而游離酶 的最適溫度為 50 C 而固 定化酶在 50- 65 C 范圍 內(nèi)都保持了較高的酶活力 ,這說明殼聚酶經(jīng)固定化 后其在較高溫度下的適應 范圍有了明顯提高 3.固定化酶的最適溫度的變化 固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高， 所以固定化酶的最適溫度提高 當然，也有報道最適溫度不變或下降的。 4.最適 pH值的變化 酶的催化能力對外部環(huán)境特別是 pH非常敏感。 酶固定化后，對底物作用的最適 pH和 pH-活性曲 線常常發(fā)
9、生偏移。 pH對固定化酶的影響 1） 載體帶負電荷， pH向堿性方向移動。 載體帶正電荷， pH向酸性方向移動。 （ 2）產(chǎn)物性質(zhì)對體系 pH的影響 催化反應的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的最適 pH比游離酶的最適 pH值；反之則低 例 :取 0.2g DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶與 5mL殼 聚糖酶液各 8份分別于不同 pH下測定固定化酶和游 離酶的活力 可見：固定化酶的最適 pH 向酸性偏移 例：取 0.15g固定化黃曲 霉毒素解毒酶 和 4ML黃曲 霉毒素解毒酶 液各 8份， 分別于不同 pH下測定固定 化酶和游離酶的活力 可見：固定化酶的最適 pH 向堿性偏移 影響固定化酶 Km的因素：
10、1.酶的空間立體障礙 載體為電中性時，由于 擴散限制 造成表觀 Km上升。 2. 電荷效應 （ 1） 載體與底物帶相同電荷， KmKm （ 2） 載體與底物電荷相反，靜電作用， KmKm 3.溶液的離子強度 5.固定化酶的米氏常數(shù)（ Km）變化 例：取 DEAE 纖維素固定化 殼聚糖酶 0.2g 與 1%殼聚糖 酶液 5mL 各 6 份分別加入 2mL 不同濃度的 殼聚糖溶 液 (0.4% 1.5%)于 50 C 水 浴中保溫 60min 測定還原 糖濃度，用雙倒數(shù)作圖求 得米氏常數(shù) 如圖 ：經(jīng)線性擬合可求得 Km(固 )=18.87g/L Km(游 ) =2.49g/L 五、評價固定化酶的指
11、標 一般評價： 1 酶活定義（ IU)：在特定條件下，每一分鐘 催化一個微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為 1 個酶活單位。 2. 酶比活定義（游離）：每毫克所具有的酶 活力單位 固定化酶 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有 的酶活力單位。 或：單位面積（ cm2）的酶活力單位表示（酶膜、 酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標。 連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活 力一半所需要的時間（ t1/2） 3.偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量 (或酶活力 )的百分數(shù)表示： 由于在偶聯(lián)反應中酶往往會有些失活，因此，測 定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力， 所以，仍以測定蛋白量較
12、為難確。 4. 活力回收 酶固定化 般比溶液酶的活力下降，固定化酶活 力占溶液酶活力的百分數(shù)稱為活力回收率 。 5.相對酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與 游離酶活力的比值稱為相對酶活力 六、固定化細胞 利用胞內(nèi)酶制作固定化酶時，需要破碎細胞，然 后提取酶，這就增加了工序和成本。 科學家設想直接固定含所需胞內(nèi)酶的細胞 固定化細胞與固定化酶比較，其 優(yōu)越性 在于： 保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境 ，因而更穩(wěn)定。 保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，而且無需輔酶再生 。 20世紀 70年代，科學家研制成固定化細胞，并且用于 生產(chǎn)。 例如，將酵母菌細胞吸附到多孔塑料的表面上或 包埋在瓊脂中，制成的固
13、定化酵母菌細胞，可以 用于酒類的發(fā)酵生產(chǎn) 固定化增殖細胞 發(fā)酵 更具有顯著優(yōu)越性 固定化細胞分類、形態(tài)特征和生理狀態(tài) ： 分類方式 固定化細胞類型 細胞類型 微生物、植 物、動 物 生理狀態(tài) 死細胞：完整細胞，細胞碎片，細胞器 活細胞：增殖細胞，靜止細胞，饑餓細胞 形態(tài)特征： 固定化細胞由于其用途和制備方法的不同，可以是顆粒 狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀（與吸附物形狀相 同）等， 目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體，這是因為： 不規(guī)則形狀的固定化細胞易磨損，在反應器內(nèi)尤其是 柱反應器內(nèi)易受壓變形，流速不好， 圓形珠體由于其表面積最大，與底物接觸面較大，所 以生產(chǎn)效率相對較高。 細胞被固定在載體內(nèi)在
14、形態(tài)學上一般沒有明顯的變化 。但是，掃描電鏡觀察到固定化酵母細胞膜有內(nèi)陷現(xiàn) 象。無論用海藻酸鈣、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠包 埋，都有類似情況。形成 “ 凹池 ” 的原因尚待進一步 研究。 固定化死細胞： 一般在固定化之前或之后細胞經(jīng) 過物理或化學方法的處理，如加熱、勻漿、干燥 、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加 細胞膜的滲透性或抑制副反應，所以比較適于單 酶催化的反應。 固定化靜止細胞 和 饑餓細胞 在固定化之后細胞是 活的，但是由于采用了控制措施，細胞并不生長 繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。 固定化增殖細胞 又稱固定化生長細胞，是將活細 胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應過程中保持旺
15、 盛的生長、繁殖能力的一種固定化方法。 與固定化酶和固定化死細胞比較 固定化增殖細胞能夠不斷繁殖、更新，反應所需的酶也就可以 不斷更新，而且反應酶處于天然的環(huán)境中，更加穩(wěn)定，因此， 固定化增殖細胞更適宜于連續(xù)使用。從理論上講，只要載體不 解體，不污染，就可以長期使用。固定化細胞保持了細胞原有 的全部酶活性，因此，更適合于進行多酶順序連續(xù)反應，所以 說，固定化增殖細胞在發(fā)酵工業(yè)中最有發(fā)展前途。 固定化增殖細胞發(fā)酵的優(yōu)越性 1、可增殖，細胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生 產(chǎn)菌集合體 2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時間反復使用或連續(xù)使用 3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。 (膜的 選擇通透
16、性） 4、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進行的反應 5、抗污染能力強 固定化細胞技術的局限性： (1)必須保持菌體完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。 (2)必須防止細胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其 他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。 (3)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用 ,載體形成的孔隙 大小影響高分子底物的通透性 . (4)如利用的僅是胞內(nèi)酶，而細胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要 的副產(chǎn)物； 但這些缺點并不影響它的實用價值。 固定化酶與細胞的選擇依據(jù)： 對一個特定的目的和過程來說，是采用細胞，還是采用 分離后的酶作催化劑。要 根據(jù)過程本身來決定。 一般說 :對于一步或兩步
17、的轉(zhuǎn)化過程用固定化酶較合適 。對多步轉(zhuǎn)換，采用整細胞顯然有利。 缺點： 固定化后的細胞不易與反應物接近，可能導致反應效果下降 固定化微生物和動植物細胞的應用 固定化微生物細胞：用于生產(chǎn)酒類、氨基酸、有 機酸、抗生素以及酶和輔酶，也可以用于有機溶 劑生產(chǎn)，廢水處理等 固定化植物細胞：主要用于生產(chǎn)人工種子、香精 、色素、藥物、酶等 固定化動物細胞主要用于生產(chǎn)疫苗 七、固定化酶的應用 1、在工業(yè)上的應用 用固定化酶可以生產(chǎn) L-氨基酸，葡萄糖及葡糖漿、核苷酸、 半合成的抗生素母核等 L氨基酸的生產(chǎn)：用固定化酶（氨基?；福┱鄯?DL氨 基酸可連續(xù)生產(chǎn) L氨基酸。如固定化的細胞（大腸桿菌） 生產(chǎn) L
18、Asp：以 120L柱式反應器 60天可生產(chǎn) 5噸的 L Asp。 乙酰 -DL -Ala L -Ala +乙酸 乙酰 -D Ala （ A-D-Ala） Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶 泵 儲 罐 反應產(chǎn)物 離心機 消 旋 反 應 器 固定化酶 柱子 晶體 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 固定化酶用于 水解牛奶中的 乳糖 牛奶中含有 4 3 -4 5的乳糖，乳 糖酶缺乏癥的人飲用牛奶后將導致不 良后果。用乳糖酶可以將乳糖分解為 組成乳糖的兩個單糖：半乳糖和葡萄 糖。用固定化乳糖酶反應器可以連續(xù) 處理牛奶，將乳糖分解 乳糖在溫度較低時易結(jié)晶
19、，用固定化 乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋 類產(chǎn)品中結(jié)晶改善口感。 嚴重腎臟疾病，需血液透析。過濾尿素和尿酸等代謝廢物 利用固定化脲酶透析液和活性碳構(gòu)成的體外循環(huán)裝臵 固定化脲酶：脲酶與離子交換樹脂通過微囊法制備而成的 脲酶水解尿素為氨和 CO2，氨被樹脂吸附， CO2由肺呼出， 其他代謝物由活性碳吸附 2.在醫(yī)藥治療上的應用 人工腎： 治療癌癥 正常細胞： L-Asn合成酶， Asn被消耗的同時不斷 合成維持細胞蛋白質(zhì)合成需要 癌細胞：缺少活無 L-Asn合成酶， Asn被消耗， 影響蛋白質(zhì)合成，細胞 “ 餓死 ” 用固定化的 天冬酰胺酶 治療 白血病 利用尼龍或尿素聚合物半透膜制備成微囊
20、型 L-天冬酰胺酶 , 用于白血病治療。 改變了酶的最適 pH； 微囊型酶對蛋白酶穩(wěn)定； 注射到大白鼠腹腔內(nèi)，急性毒性很低、也不會產(chǎn)生抗體； 除制成微囊型外，還有人采用酶管或酶板形式進行體外循 環(huán)治療，也達到了預期的療效。 微囊型固定化酶 將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合物內(nèi)，制成所謂的 微囊型固定化酶 。小分子底物或產(chǎn)物可自由地透過 膠囊的半透膜，而酶作為大分子則不能透過膠囊； 此外，膠囊外的一些蛋白質(zhì)、酶、抗體等高分子物 質(zhì)也不能進入膠囊內(nèi)部，這就避免了發(fā)生過敏性反 應。 膠囊型固定化 酶的另一大 優(yōu)點 是， 膠囊內(nèi)的酶仍以 溶解狀態(tài)作用于底物 。因此突破了狹義的固定化酶的 定義，也為固定化酶應
21、用于臨床提供了可能性。 與此同時，人們采用人血清白蛋白替代尼龍、硝酸 纖維等作為制造膠囊的材料，使包裝材料更具有安全、 穩(wěn)定和體內(nèi)易代謝等特點。 是一種與 x染色體連鎖 的遺傳代謝病 患者由于先天性缺 乏 HGPRT，導致體內(nèi)次 黃嘌呤和鳥嘌呤補救途 徑的障礙，并進而引起 腎結(jié)石、痛風。 Lesch-Nyhan綜合癥 Chang等人利用 微囊型 嘌呤氧化酶治療 Lesch-Nyhan綜合癥，使次黃嘌呤的水平顯 著下降，同時發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤能很快地進 入 微 囊體 中并被代謝。 在以兩歲半大的病孩所 做的臨床試驗中，他們也發(fā)現(xiàn)效果很好。 藥物控釋載體： 新的藥物（包括化學合成藥、天然藥物及基因工程藥
22、物）不 斷問世，但將它們應用于臨床卻并不很順利： 很多藥物尤其是蛋白質(zhì)類藥物，口服易被胃酸破壞或沉淀； 單純注射后瞬時血藥濃度升高，但馬上被肝臟及血液中的酶 系統(tǒng)所清除，需要反復注射，不僅增加治療費用，而且增加 了感染的機會； 腫瘤化療用細胞毒性物質(zhì)選擇性較差，全身毒副作用嚴重； 有些藥物如反義核酸親水性強難于穿過細胞膜； 蛋白質(zhì)類藥物容易引起免疫反應； 很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。 以上問題往往不能用簡單的藥物改構(gòu)來完成，因此， 為藥劑學工作者提出了嚴峻的任務。近 30年來，藥物 的新劑型發(fā)展很快，已逐步建立了基于藥物理化性質(zhì) 及作用特點的合理給藥體系， 其核心特點是從時間和 空間分布上控制
23、藥物的釋放。 在腫瘤的化學治療及重組蛋白質(zhì)類藥物制劑中比較 重要的幾種控釋體系有 聚合物修飾、凝膠包埋、微 球、脂質(zhì)體及免疫導向等 。 這幾種控釋體系都涉及到將藥物與聚合物載體偶聯(lián) 或固定于某種聚合物載體上，因此也可稱為 載體藥 物 聚合物修飾 多用于 蛋白質(zhì)類藥物 。這類藥物生物半衰期短、免疫 原性強，可用適當?shù)乃苄愿叻肿泳酆衔锛右孕揎椧?改善其性能。 羧甲基殼聚糖對天門冬酰胺酶的修飾 ,聚 乙二醇對原核表達重組人血小板生成素 分子的修飾等，均可起到降低毒性、延 長半衰期的作用。 此外，小分子藥物也可使用這一系統(tǒng)， 如將抗癌藥，羥基硫胺素及氨甲蝶呤偶 聯(lián)于羧甲基纖維素后注射，可使荷瘤小 鼠
24、平均生存時間較對照組延長 2倍左右。 凝膠包埋 即用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制 成含有藥物的凝膠，植入體內(nèi)特定部位，以達到 緩釋給藥的效果。 藥物從凝膠中釋出后，經(jīng)周圍組織吸收，然后進 入血液循環(huán)或直接局部作用， 避開了首過效應 ， 生物利用度高，作用時間長。 微球制劑 用高聚物微球包埋或化學偶聯(lián)藥物可制成微球 制劑，它具有：靶向性、緩釋性及減少抗藥性 等特點。微球與靶細胞接觸，可以通過胞飲進 入胞內(nèi)發(fā)生作用，不影響細胞膜通透性，不會 產(chǎn)生抗藥性。 早期使用的微球制劑為不被生物降解的，多為口 服制劑?，F(xiàn)在用于注射的多為可生物降解小于 1 m的微球， 如以生物可降解微球包埋入生長激素
25、肌注動物， 血藥濃度穩(wěn)定、不產(chǎn)生抗體，注射部位組織無病 變。微球還可用于基因治療及基因疫苗的載體。 脂質(zhì)體 -磷脂雙分子層在水溶液中，自發(fā)形成的超微型中空小泡。 現(xiàn)查明是因缺乏氨基己糖酶 A，使神經(jīng)節(jié)苷脂累積在組 織內(nèi)，從而出現(xiàn)神經(jīng)遲鈍、肌肉無力、失聰、視網(wǎng)膜有櫻 桃紅點等癥狀 . 黑蒙性癡呆 (Tay-Sach病 ) Weisman等用被覆抗體的脂質(zhì)體（內(nèi)含 氨基己糖酶 A）引入到 4例黑蒙性癡呆患者 細胞中，此時細胞不會把含酶的 脂質(zhì)體 當 作異物。故能通過細胞膜進入細胞內(nèi)，在 細胞內(nèi)發(fā)揮酶的作用 。 此外，還有人利用嵌入從胎盤中提 純的葡萄糖腦苷酯酶的脂質(zhì)體來治療 Gaucher病，發(fā)現(xiàn)
26、也能獲得較好的療效。 缺點 : 單純脂質(zhì)體也還是依靠被動靶向性，因而 限制了其在腫瘤化療中的應用； 脂質(zhì)體在胃腸道轉(zhuǎn)運、分布不穩(wěn)定，缺乏 對血管的通透性。 等等 導向藥物 導向藥物具有主動靶向性，將針對腫瘤細胞的單 克隆抗體與化療藥物化學交聯(lián)，可以直接作用于 腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用，并且降低全身毒性。 半透膜 酶膠層 感應電極 酶電極示意圖 3.在分析化學中的應用 在分析化學與臨床診斷中 ， 固定化酶被制成酶試紙 、 酶柱 與酶管 、 酶電極而得到廣泛的應用 。 4.在基礎理論研究中的應用 主要集中在酶本身的生化和分子生物學研究以及蛋白質(zhì) 、 核 酸和遺傳工程中的研究應用 。 此外，固定化酶及其
27、技術，還可以用于研究微生物的代謝機 理，研究生物發(fā)光機理等。 1）生物化學及分子生物學基礎研究 如：酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究、多亞基酶及多酶體 系組裝方式的研究及凝血及血栓溶解的生化過程 研究等。利用固定化酶在相界面催化反應的特點 ，還可用它來復制酶膜的模型。將多酶系統(tǒng)包埋 于微囊內(nèi)，可用于酶系統(tǒng)的組裝、定位及代謝的 研究等 闡明酶反應機理 對于葡萄糖生成 3-磷酸甘油醛反應，中間要經(jīng)過 已糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶、 醛縮酶的作用。將這些酶固定化后裝柱，讓葡萄 糖依次過柱，果然可得 3-磷酸甘油醛，這既說明 了每一個酶的作用，也可證明了該反應的反應機 制。 酶亞基性質(zhì)的研究 因為亞基
28、不易分離，正常條件下無法比較 由于載體的空間限制，脫落的亞基不能再與載體上的亞基 重新結(jié)合，利于單亞基的研究 8 M 尿 素 透 析 醛縮酶有 4個亞基，控制條件使酶分子只有一個亞基通過共 價鍵與 CNBr活化的瓊脂糖凝膠結(jié)合。當用 8 mol/L的尿素使 蛋白變性后，未被固定的亞基被透析除去，只有固定化的亞 基保留，這樣就可對單亞基進行研究， 醛縮酶的亞基可有活性。 固定化衍生物 活力 蛋白質(zhì) 比活 全酶 100 100 4.5 亞基 9.8 27.5 1.6 揭示酶原激活機理 有時酶原激活并不涉及蛋白水解。酪氨酸酶原固定 化后，不須肽鏈水解就可活化至天然酶的 2030%活 力。熒光技術證明，活化酶原在結(jié)構(gòu)上與固定化酪 氨酸酶類似，證明了 結(jié)構(gòu)重排在酶原激活中的重要 性 。 此外： 蛋白質(zhì)在載體上的固定化可用于粗略闡明蛋白質(zhì) 的結(jié)構(gòu)。例如，蔗糖酶固定在帶電載體上，蛋白 質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中的許多鹽橋被破壞，而酶在很大程 度上失去穩(wěn)定性。這個事實說明，靜電相互作用 （特別是鹽橋）是蔗糖酶結(jié)構(gòu)完整性所必須的 固定化酶在實際中的其他應用 醫(yī)藥 農(nóng)業(yè) 環(huán)保 食品 其他
固定化酶及固定化技術
