微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教案.doc

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______________________________________________________________________________________________________________ 微 生 物 實(shí) 驗(yàn) 教 案 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 以染色玻片為例，熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 1 顯微鏡油鏡使用的原理 1普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造 （1）光學(xué)部分: 接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大, 造成物象。 （2）機(jī)械部分: 鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。 2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 （1）放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù) （2）顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。 λ：可見(jiàn)光的波長(zhǎng)（平均0.55μm） n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 a：鏡口角（即入射角）。 3油鏡使用的原理 油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。 2枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的玻片染色標(biāo)本。 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 （1）用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 （2）調(diào)節(jié)光亮度。 （3）低倍鏡觀察：先粗調(diào)再微調(diào)至物象清晰。 （4）轉(zhuǎn)入中倍、高倍觀察，每一不只需調(diào)微調(diào)旋紐即可看到清晰的物象。 （5）油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。 （6）繪出所觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖像。 （7）、換片：另?yè)Q新片觀察，必須從（3）步開(kāi)始操作。 （8）、用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去油鏡頭上的香柏油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 油鏡使用的原理 繪制細(xì)菌形態(tài) 六、思考題 1油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？ 2使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？ 七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。 2鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。 3觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 4觀察時(shí)，兩眼睜開(kāi)，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。 5拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 6顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。 八、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。學(xué)習(xí)染色的基本技術(shù)， 二、實(shí)驗(yàn)原理 簡(jiǎn)單染色的原理 大多數(shù)微生物細(xì)胞質(zhì)是帶負(fù)電荷，簡(jiǎn)單染色時(shí)采用已知的、帶正電荷的堿性染料。染料適用于熱固定的涂片，染料與菌體細(xì)胞質(zhì)黏附使菌體著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明對(duì)比。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。 2、培養(yǎng)12-18h的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌。 3、簡(jiǎn)單染色液（美藍(lán)染色液、黑色素液或炭素墨水） 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1、活菌制片觀察 取一張干凈的載玻片，在其中央滴上一滴干凈的蒸餾水，取培養(yǎng)12-18h的枯草芽孢桿菌一小環(huán)，在水滴上反復(fù)涂抹至菌體充分分散，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的水分，按照油鏡的使用步驟，觀察草芽孢桿菌形態(tài)，邊觀察邊繪圖。 2、簡(jiǎn)單染色 (1) 涂片:取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無(wú)菌操作分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調(diào)勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時(shí)不宜過(guò)多，涂片必須均勻。 (2) 干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。 (3) 固定:于火焰上通過(guò)2—3次。 (4) 染色：在整個(gè)涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。 （5）水洗：傾去染液，用自來(lái)水細(xì)流沖洗至流下的水中無(wú)染料顏色為止。 （6）干燥：空氣中自然干燥或在酒精燈高處微微加熱。 （7）鏡檢：在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 油鏡使用的原理 繪制細(xì)菌形態(tài) 六、思考題 1鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？ 2根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 七、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的革蘭氏染色 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1掌握革蘭氏染色。 2了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中的重要性。 二、實(shí)驗(yàn)原理 1 革蘭氏染色的原理 革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要有肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，在染色過(guò)程中，當(dāng)用95%乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，細(xì)胞壁的通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞壁內(nèi)而不易脫色，因此呈藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類(lèi)物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類(lèi)物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物容易被乙醇抽提出來(lái)而脫色，然后又被染上了復(fù)染劑的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1大腸桿菌24h的斜面培養(yǎng)物。 2葡萄球菌24h的斜面培養(yǎng)物。 4革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅） 5載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。 6顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。 四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟 附表1細(xì)菌染色法分類(lèi) 附表2 微生物染色常用染料 A酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。 B堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 C中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于細(xì)胞核染色）。 D單純?nèi)旧哼@類(lèi)染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類(lèi)（Sudan b）的染料 2革蘭氏染色 （1）涂片。 （2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。 （3）媒染：先用新配的盧哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。 （4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。 （5）復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 （6）鏡檢：觀察染色結(jié)果。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1 革蘭氏染色的基本原理和意義 2 革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵 六、思考題 1根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 2制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？ 3做革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？ 4當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠? 七、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)四 培養(yǎng)基的配制 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟 2學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)室滅菌鍋的使用方法 二、實(shí)驗(yàn)材料 1牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。 2試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線繩、紗布。 3 滅菌鍋 三、實(shí)驗(yàn)方法 (一)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。 1稱(chēng)藥品：按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱(chēng)取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱(chēng)量紙上稱(chēng)量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱(chēng)量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。 2加熱溶解：在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過(guò)程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。 3調(diào)pH：檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。 4過(guò)濾：液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀察。 5分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜，滅菌后垂直待凝。 6加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約3／5塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。 7包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、日期。 8滅菌：將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫存。 9擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜度，使斜度的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)度的1/2。 10無(wú)菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24-48h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用?；騼?chǔ)存于冰箱清潔的櫥內(nèi)，備用。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告 記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)第的名稱(chēng)、數(shù)量，并圖解說(shuō)明其配制過(guò)程，指明要點(diǎn)。 五、問(wèn)題和思考 1配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么? 2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？如何進(jìn)行無(wú)菌檢查， 3試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無(wú)菌檢查。 六、演示 1培養(yǎng)基的分裝方法。 2試管斜面的擱置方法 七、注意事項(xiàng) 稱(chēng)藥品用的牛角匙不要混用，稱(chēng)完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)PH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。 八、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)五 土壤的稀釋、分離、純化及無(wú)菌操作技術(shù) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容 1學(xué)習(xí)從上壤中分離微生物的方法，學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)。 2用稀釋法分離細(xì)菌、放線茵和霉菌。 3用平板劃線法分離微生物。 4學(xué)習(xí)平板接種等無(wú)菌操作技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)材料 1金黃色葡萄球菌和普通變形菌斜面菌種。 2已滅菌的牛肉膏、高氏1號(hào)、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶。 3無(wú)菌培養(yǎng)皿12套、無(wú)菌EP管10支、土壤樣品、天平、稱(chēng)量紙、藥匙、試管架、記號(hào)筆、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul槍頭、200ul槍頭、20ul槍頭。 4無(wú)菌水(49.5mL、帶玻璃珠) 1瓶、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。 三、實(shí)驗(yàn)方法 (一)土壤稀釋分離 1取土壤：取表層以下5-10ml處的土樣．放入滅菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。 2制備稀釋液 (1)制備土壤懸液：稱(chēng)土樣0.5g，迅速倒人帶玻璃珠的無(wú)菌水瓶中，振蕩5-10min,使土壤充分打散，即成為10-2的土壤懸液。 (2)梯度稀釋?zhuān)河靡埔浩魑?0-2的土壤懸液100ul，放入裝有900ul無(wú)菌水的EP管中，上下顛倒數(shù)次，即為10-3的稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3-10-8的稀釋液。 注意：每一個(gè)稀釋度換用一支槍頭。 (二)平板劃線分離微生物 1倒平板：按無(wú)菌操作要求，在火焰旁操作，取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基(約50℃)，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒量以鋪滿(mǎn)皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。 2劃線分離：使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落。 3培養(yǎng)：方法同“土壤稀釋分離” (三) 平板接種培養(yǎng) 1混合平板培養(yǎng)法 將無(wú)菌平板編上10-7、10-8、10-9號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)，用無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號(hào)10-9的3個(gè)平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號(hào)10-8的3個(gè)平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中（由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換）。然后在9個(gè)平板中分別倒入已融化并冷卻至45—50℃的細(xì)菌培養(yǎng)基(圖22-2)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。 2涂抹平板計(jì)數(shù)法 涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無(wú)菌吸管吸取0.1ml菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)）。再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告 1記錄土壤稀釋分離結(jié)果，并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌、放線曲和霉菌的數(shù)量。 計(jì)算方法：選擇長(zhǎng)出菌落數(shù)30-300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，技以下公式： 總個(gè)數(shù)／g＝同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù) 2分別記錄平板劃線、平板接種的結(jié)果，并自我評(píng)價(jià)。 五、問(wèn)題和思考 1在測(cè)定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法? 2試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離出酵母菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 3試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從水或者空氣中分離微生物，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 六、注意事項(xiàng) 1一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見(jiàn)于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細(xì)菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù)。 2在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。 3放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。 六、教學(xué)反饋 實(shí)驗(yàn)六 水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ??? (1)了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定原理和測(cè)定意義。 ??? (2)學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。 ??? (3)學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測(cè)方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ??? 水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來(lái)源有：水中的水生性微生物(如光合藻類(lèi))、來(lái)自土壤徑流、降雨的外來(lái)菌群和來(lái)自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來(lái)源于人和動(dòng)物的傳染性排泄物。 ??? 水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過(guò)3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每mL不超過(guò)100個(gè)。 ??? 所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。 ??? 所謂大腸菌群，是指在37℃24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的總稱(chēng)，主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。 ??? 水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可隨人畜排泄物進(jìn)入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，國(guó)際上已公認(rèn)大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對(duì)飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。 ???水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。濾膜法僅適用于自來(lái)水和深井水，操作簡(jiǎn)單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。 多管發(fā)酵法包括初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)三個(gè)部分。 1、初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管，乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。 水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37℃下培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說(shuō)明水中存在大腸菌群為陽(yáng)性結(jié)果，但也有個(gè)別其他類(lèi)型的細(xì)菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說(shuō)明是陰性結(jié)果，在少量的情況下，也可能延遲到48小時(shí)后才產(chǎn)氣，此時(shí)應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實(shí)驗(yàn)，才能確定是否是大腸菌群。48小時(shí)后仍產(chǎn)氣的陰性結(jié)果。 2、平板分離： 平板培養(yǎng)基一般使用復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，Endo’s medium）或尹紅美藍(lán)瓊脂(eos in methylene blue agar,EMB agar),前者含有堿性復(fù)紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復(fù)紅反應(yīng)，形成深紅色復(fù)合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，尹紅美藍(lán)瓊脂平板含有與美藍(lán)染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色(龍膽紫的紫色)菌落。初發(fā)酵管24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。 3、復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)： 以上大腸菌群陽(yáng)性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌者，通過(guò)此實(shí)驗(yàn)再進(jìn)一步證實(shí)。原理與初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相同，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽(yáng)性結(jié)果。 三、實(shí)驗(yàn)器材 1菌落總數(shù)的測(cè)定： 1)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水。 2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。 2大腸菌群的測(cè)定； （1）、培養(yǎng)基：乳糖蛋白胨發(fā)酵管(內(nèi)有倒置小套管)，三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管(瓶)( 內(nèi)有倒置小套管)，尹紅美藍(lán)瓊脂平板； 2）、材料：無(wú)菌水、載玻片、滅菌帶玻璃塞空瓶、無(wú)菌吸管、無(wú)菌試管等。 四、實(shí)驗(yàn)方法 ?(1)水樣的采集： ???1)自來(lái)水：先將自來(lái)水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開(kāi)放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。 ??? 2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿(mǎn)后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕?。如果不能?h內(nèi)檢測(cè)的，需放入冰箱中保存。 ??? (2)細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定： ??? 1)水樣稀釋及培養(yǎng)： ??? ①按無(wú)菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋?zhuān)? ??? ⑦根據(jù)對(duì)水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度(飲用水如自來(lái)水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水—被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。 ??? ③將熔化后保溫度45℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。 ??? ④待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。 ??? 2)計(jì)算方法： ??? 作平板計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。 ?3)計(jì)數(shù)的報(bào)告： ?①平板菌落數(shù)的選擇： ??? 選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。 ??? ②稀釋度的選擇： a. 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表1例1)。 ??? b．若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若比值大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字(l例2、例3)。 c．若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(l例4)。 d．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(1例5)。 e. 若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例6)。 ??? f. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表l例7)。 ??? ③細(xì)菌總數(shù)的報(bào)告： ??? 細(xì)菌的菌落數(shù)在l00以?xún)?nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示，如表1“報(bào)告方式”一欄所示。 (3)大腸菌群的測(cè)定(多管發(fā)酵法)： (一)自來(lái)水檢查： 1、初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 在2個(gè)含有50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵瓶中，各加入100ml水樣；在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml水樣(見(jiàn)圖)。搖勻后，37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)。 2、平板分離 經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管(瓶)，分別劃線接種于尹紅美藍(lán)瓊脂平板上，再于37℃下培養(yǎng)18-24小時(shí)，將符合下列特征的菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。 ⑴深紫黑色、有金屬光澤。⑵紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；⑶淡紫紅色、中心顏色較深。 3、復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的同類(lèi)型菌落1-3個(gè)，37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。 證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵的陽(yáng)性管(瓶)數(shù)查表，即得大腸菌群數(shù)(見(jiàn)表一)。 表一 接種水樣總量300ml(100ml2份、10ml10份) 100ml水量陽(yáng)性管數(shù) 10ml水量陽(yáng)性管數(shù) 0 1 2 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 0 <3 4 11 1 3 8 18 2 7 13 27 3 11 18 38 4 14 24 52 5 18 30 70 6 22 36 92 7 27 43 120 8 31 51 161 9 36 60 230 10 40 69 >230 （二）、池水、河水或湖水等的檢查： 1、將水樣稀釋成10-1與10-2。 2、分別吸取1ml10-2、10-1的稀釋水樣和1ml原水樣，各注入裝有10ml普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管(瓶)中。 3、以下步驟同自來(lái)水的平板分離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 4、將100、10、1、0.1(10-1)ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表見(jiàn)表二：將10、1、0.1(10-1)、0.01(10-2) ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表見(jiàn)表三：即得每升水樣中大腸菌群數(shù) 表二 接種水樣總量111.1ml(100、10、1、0.1ml各1份) 接種水樣量(ml) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 100 10 1 0.1 - - - - <9 - - - + 9 - - + - 9 - + - - 9.5 - - + + 18 - + - + 19 - + + - 22 + - - - 23 - + + + 28 + - - + 92 + - + - 94 + - + + 180 + + - - 230 + + - + 960 + + + - 2380 + + + + >2380 表三 接種水樣總量11.11ml(10、10、0.1、0.01ml各1份) 接種水樣量(ml) 每升水樣中 大腸菌群數(shù) 10 1 0.1 0.01 - - - - 90 - - - + 90 - - + - 90 - + - - 95 - - + + 180 - + - + 190 - + + - 220 + - - - 230 - + + + 280 + - - + 920 + - + - 940 + - + + 1800 + + - - 2300 + + - + 9600 + + + - 23800 + + + + 23800 “+”發(fā)酵陽(yáng)性、“-”發(fā)酵陰性 表 1 稀釋度的選擇及細(xì)菌數(shù)報(bào)告方式 ? 稀釋度及菌落數(shù) 兩稀釋度之比 菌落總數(shù)/（cfu/g或cfu/mL） 報(bào)告方式（菌落總數(shù)）/（cfu/mL或cfu/g） 10-1 10-2 10-3 1 多不可計(jì) 164 20 - 16400 16000或1.6×104 2 多不可計(jì) 295 46 1.6 37750 38000或3.8×104 3 多不可計(jì) 271 60 2.2 27100 27000或2.7×104 4 多不可計(jì) 多不可計(jì) 313 - 313000 310000或3.1×105 5 27 11 5 - 270 270或 6 0 0 0 - ＜10 ＜10 7 多不可計(jì) 305 12 - 30500 31000或3.1×104 1)生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)： ? ??? 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 1、結(jié)果： (1)自來(lái)水 100ml水樣的陽(yáng)性管數(shù)是多少？ 10ml水樣的陽(yáng)性管數(shù)是多少？ 查表一得每升水樣中大腸菌群是多少？ (2)池水、河水或湖水 陽(yáng)性結(jié)果記“+”；陰性結(jié)果記“-”。 查表二得每升水樣中大腸菌群是多少？ 查表三得每升水樣中大腸菌群是多少？ 2、思考題： p188(1-3) 六、教學(xué)反饋  THANKS !!! 致力為企業(yè)和個(gè)人提供合同協(xié)議，策劃案計(jì)劃書(shū)，學(xué)習(xí)課件等等 打造全網(wǎng)一站式需求 歡迎您的下載，資料僅供參考 -可編輯修改-