《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》PPT課件

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1、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)及影響試驗(yàn)結(jié)果的因素分析 一、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 二、影響試驗(yàn)結(jié)果的因素分析 三、企業(yè)產(chǎn)品優(yōu)勢(shì),一、試驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 2005年版中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程P297細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 實(shí)驗(yàn)前，須用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。 在使用洗耳球、移液管取樣時(shí)，應(yīng)注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內(nèi)毒素進(jìn)入供試液。 復(fù)溶0.5ml鱟試劑時(shí)，在旋渦混合器上點(diǎn)擊1-3秒，促進(jìn)鱟試劑的溶解。,由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過(guò)程中及觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)注意不要使試管受到振動(dòng)，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。 進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并使用同一支細(xì)菌內(nèi)毒素

2、標(biāo)準(zhǔn)品。,在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)中要求的對(duì)照應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。 在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)中要求的對(duì)照應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。,二、試驗(yàn)誤差分析及改進(jìn)措施 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)及使用的影響 實(shí)驗(yàn)器皿的的影響 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 實(shí)驗(yàn)員的影響 環(huán)境的影響,1、鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 鱟試劑的質(zhì)量：抗干擾能力，穩(wěn)定性； 鱟試劑靈敏度標(biāo)示值的準(zhǔn)確性 。,1）、鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)

3、定？ 標(biāo)示值是否準(zhǔn)確？ 不同廠家的鱟試劑雖然標(biāo)示值（）相同，但仍然存在較大的誤差。比如，標(biāo)示值為0.5EU/ml的鱟試劑，有的真實(shí)靈敏度可能是0.65EU/ml；而另一個(gè)廠家的鱟試劑可能是0.30EU/ml時(shí)，按0.5-2誤差標(biāo)準(zhǔn)都是合格產(chǎn)品，但對(duì)同一檢品在相同的稀釋倍數(shù)下，這兩個(gè)廠家的鱟試劑產(chǎn)品對(duì)內(nèi)毒素的檢出水平卻不同。,我本公司對(duì)鱟試劑質(zhì)量得控制： 原料；工藝用水；生產(chǎn)環(huán)節(jié)；靈敏度標(biāo)定。,鱟試劑的活性只能控制在某一個(gè)范圍內(nèi)，不可能控制在一個(gè)點(diǎn)，我們要求允許波動(dòng)的范圍盡可能的小減少批間誤差。,2、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作

4、誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素單位表示誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯(cuò)誤使用,1）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照。 2005年版中國(guó)藥典,2）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價(jià)存在一定的誤差，用不同細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈

5、敏度時(shí)可能存在一定的誤差。中國(guó)藥典要求“當(dāng)c在0.5-2(包括0.5和2)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度?！痹囼?yàn)結(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。,3）、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差,取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。,,,正確,（易折點(diǎn)）錯(cuò)誤,注意：只能在安瓿的易折點(diǎn)上部開(kāi)啟內(nèi)毒素，不能沿易折點(diǎn)開(kāi)啟，防止振蕩過(guò)程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，可按其使用說(shuō)明書中的方法將其稀釋

6、至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，為一次性使用。,4）、錯(cuò)誤使用 有部分客戶使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種錯(cuò)誤行為，更有甚者使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)交叉復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種嚴(yán)重錯(cuò)誤行為。,3、實(shí)驗(yàn)器皿的影響 器皿的計(jì)量管理（校正） 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 器皿的正確處理,1）、器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 鱟試驗(yàn)對(duì)器皿的要求：刻度準(zhǔn)確；內(nèi)表面光滑；易于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過(guò)校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確，內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，故不宜選用注射器。,如果用量不大，使用頻率不高，

7、建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無(wú)熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無(wú)內(nèi)毒素和-葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括, 無(wú)熱原試管、無(wú)熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來(lái)很大方便,另外，當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差時(shí)可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。,2）、器皿的正確處理 2005年版中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范278頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備”規(guī)定：“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來(lái)水洗凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時(shí)，取出將洗液瀝干，用自來(lái)水將殘余的洗液洗凈，再用蒸,餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素?！?應(yīng)該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定

8、最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗?！庇械目蛻羰褂梅礉B透制備的純化水沖洗試驗(yàn)用玻璃器皿，結(jié)果試驗(yàn)中所有的陽(yáng)性對(duì),照都為陰性，復(fù)核鱟試劑靈敏度時(shí)試驗(yàn)結(jié)果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽(yáng)離子經(jīng)250高溫干烤不能完全被破壞，這時(shí)不同的離子就產(chǎn)生對(duì)鱟試劑酶反應(yīng)抑制或增強(qiáng)的反應(yīng)，為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢驗(yàn)報(bào)告的權(quán)威性，我們應(yīng)該嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗(yàn)用玻璃器皿。,移液管浸泡洗液時(shí)，應(yīng)如何放置？ A、正 B、反 反放（尖端向上）的優(yōu)點(diǎn)？ 1、保護(hù)移液管刻度的準(zhǔn)確性； 2、防止標(biāo)本缸底部結(jié)晶體堵塞移液管。,4、樣品成份及理

9、化性質(zhì)的影響 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 PH值的影響 金屬離子和弱酸陰離子的影響 藥物濃度的影響,1）、 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 常見(jiàn)現(xiàn)象：假陽(yáng)性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測(cè)出被測(cè)物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯(cuò)判為內(nèi)毒素。,目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和-葡聚糖，而內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過(guò)0點(diǎn)的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，是將其它物質(zhì)（如-葡聚糖）判定為內(nèi)毒素，錯(cuò)誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經(jīng)濟(jì)損失。,鱟試劑反應(yīng)機(jī)理圖,判斷假陽(yáng)性的方法： 1、特異性鱟試

10、劑法； 2、定量反應(yīng)曲線分析法； 3、家兔模擬試驗(yàn)法。,假陽(yáng)性事件： 1、2003年山東省青州某制藥廠，5%葡萄糖注射液（規(guī)格：100ml 產(chǎn)品批號(hào)：0307040101）； 2、2004年廣東省湛江某制藥公司，Vc注射液（產(chǎn)品批號(hào)：）； 3、2006年上海市某制藥公司，塑瓶裝5%葡萄糖注射液（產(chǎn)品批號(hào)：0501142）；,2）、PH值對(duì)反應(yīng)速度的影響 常見(jiàn)現(xiàn)象：樣品陽(yáng)性不成立。 鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10時(shí)，酶活性受到抑制。,,,,,相對(duì)活力,PH,7.0,PH對(duì)反應(yīng)速度的影響: 影響酶原的激活； 影響酶分子的構(gòu)象，過(guò)高過(guò)低的PH會(huì)改變酶的活性中心的構(gòu)象

11、，或甚至改變整個(gè)酶分子的機(jī)構(gòu)使其變性失活。,故鱟試驗(yàn)時(shí)，供試品 pH 最好應(yīng)預(yù)調(diào)和6.5-8.0 為好，必要時(shí)可用無(wú)內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調(diào)節(jié) pH 值。美國(guó)、日本藥局方以及中國(guó)藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8.0。,成功案例： 1、頭孢吡肟 2、鹽酸土霉素、土霉素 3、喹諾酮類輸液 4、血液保存液、紅細(xì)胞保存液,3）、金屬離子和弱酸陰離子 離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果影響較大，一方面陽(yáng)離子如Fe3+、Al3+強(qiáng)度較大會(huì)引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過(guò)高，同時(shí)還必須注意高價(jià)陽(yáng)離子（如Fe3+）的氧化性對(duì)鱟試劑酶反應(yīng)具有強(qiáng)抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、P

12、b2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。,許多藥物因PH值10時(shí)，其中的陰離子會(huì)吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子，使實(shí)驗(yàn)呈假陰性。,成功案例： 1、碳酸氫鈉注射液 2、乙肝疫苗 3、注射用果糖二磷酸鈉,4）、藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉 4、中藥類注射液,5、實(shí)驗(yàn)員的影響 操作時(shí)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，安瓿開(kāi)啟前應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時(shí)，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確。如果一人獨(dú)立完成試驗(yàn)，可先稀釋配制好內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和

13、樣品溶液，然后開(kāi)啟復(fù)溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時(shí)間（最好控制在15分鐘內(nèi)）。,6、環(huán)境的影響 保溫時(shí)間 保溫溫度 1）、保溫溫度 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實(shí)驗(yàn)中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達(dá)49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。,從實(shí)驗(yàn)可以看出，溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在2541之間，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度也升高，41尚未達(dá)到反應(yīng)速度峰值，25 時(shí)反應(yīng)速度已相當(dāng)快；在4146之間，溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度無(wú)明顯影響；達(dá)到49或更

14、高溫度時(shí)，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應(yīng)速度反而降低。,2）、保溫時(shí)間 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，37保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而堅(jiān)固。,因此夏天室溫較高，如果試驗(yàn)操作時(shí)間太長(zhǎng)，細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不等進(jìn)入反應(yīng)儀器反應(yīng)已開(kāi)始，實(shí)際反應(yīng)時(shí)間超過(guò)1小時(shí)。由于室溫不同，冬夏季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會(huì)很大。即使在25準(zhǔn)室溫下操作，操作時(shí)間拖得過(guò)長(zhǎng)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量較高時(shí)，測(cè)定誤差也不會(huì)小。,三、企業(yè)產(chǎn)品優(yōu)勢(shì) 1、能準(zhǔn)確判斷假陽(yáng)性 用本企業(yè)研制生產(chǎn)的定量鱟試劑第一家準(zhǔn)確無(wú)

15、誤地檢測(cè)出了內(nèi)毒素與葡聚糖二者之間的區(qū)別，并公布了內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素反應(yīng)曲線。截止目前，還沒(méi)有第二個(gè)品牌的鱟試劑將假陽(yáng)性區(qū)別出來(lái)，其他國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)也未公布同類型曲線。 對(duì)于假陽(yáng)性的鑒別已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)走在了世界同行業(yè)的前面。,2、對(duì)外交流歷史悠久，全面掌握中美兩國(guó)鱟試劑的區(qū)別 1）對(duì)外交流我公司歷史最悠久、交流技術(shù)最全面； 2）我公司掌握了中國(guó)和美國(guó)鱟試劑的全面區(qū)別； 3）用美國(guó)和中國(guó)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，我公司鱟試劑標(biāo)示靈敏度都相當(dāng)準(zhǔn)確。 4）通過(guò)十多年的技術(shù)交流結(jié)果顯示，本公司的鱟試劑與美國(guó)同類產(chǎn)品質(zhì)量相比沒(méi)有任何差別，而且個(gè)別項(xiàng)目要優(yōu)于美國(guó)產(chǎn)品。,三、售后技術(shù)服務(wù)專業(yè)，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

16、在我國(guó)已開(kāi)展了十多年，經(jīng)過(guò)許許多多專家學(xué)者的努力，目前該行業(yè)已經(jīng)取得了非常重要的成果，但是該領(lǐng)域仍然有許多我們無(wú)法解決問(wèn)題的存在，它并不想我們想象的那么簡(jiǎn)單，這些問(wèn)題的存在嚴(yán)重阻礙了該行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，我們將與客戶的交流以及客戶咨詢的相關(guān)問(wèn)題，進(jìn)行一次歸納總結(jié)。通過(guò)工作中出現(xiàn)的問(wèn)題有必要對(duì)以下情況進(jìn)行交流，以加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的正確理解，同時(shí)糾正一些錯(cuò)誤的觀念。,如何全面理解細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中污染物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響？ 如何正確認(rèn)識(shí)器皿洗滌的重要性？ 如何正確理解鱟試劑的抗干擾能力和鱟試劑的特異性？,許多客戶對(duì)污染的認(rèn)識(shí)是不全面或錯(cuò)誤的，他們認(rèn)為在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過(guò)程中，器皿被污染的結(jié)果必然導(dǎo)

17、致陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，但試驗(yàn)結(jié)果正好與他們的認(rèn)識(shí)有時(shí)正好相反，可能陽(yáng)性對(duì)照全為陰性，對(duì)此亦有百思不得其解。要正確理解這個(gè)問(wèn)題，首先要正確理解鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理，鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)為一系列酶反應(yīng)，生物酶反應(yīng)受許多因素的干擾。在日常工作中，我們要特別注意一些因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，如PH值、器皿的潔凈度以及環(huán)境因素等。,解決這些問(wèn)題需要非常豐富的專業(yè)知識(shí)，我們公司在專業(yè)知識(shí)方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，其他鱟試劑生產(chǎn)企業(yè)望塵莫及。 下面我們將客戶遇到的困難，其他鱟試劑生產(chǎn)企業(yè)無(wú)法解決的技術(shù)問(wèn)題，最終由我們幫助解決了的案例列舉如下：,1、輸液塑瓶溶出物聚丙烯添加劑假陽(yáng)性反應(yīng)鑒別方法； 2、鹽酸土霉素細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析回收率偏低的技術(shù)問(wèn)題； 3、陽(yáng)性對(duì)照為陰性結(jié)果的問(wèn)題； 4、頭孢類抗生素細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)假陽(yáng)性問(wèn)題； 5、乙肝疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)樣品陽(yáng)性對(duì)照為陰性問(wèn)題。,通過(guò)解決以上技術(shù)問(wèn)題，我們展示了企業(yè)的技術(shù)實(shí)力，加強(qiáng)了與客戶之間的溝通，贏得了客戶的信任，贏得了市場(chǎng)。,