《生物芯片技術(shù)》PPT課件.ppt

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1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物芯片技術(shù) 溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 第九章 免疫共沉淀（ Co-IP） Pull down assay 章節(jié)提要 生物芯片始于 上世紀(jì) 90年代 ，隨著人類基 因組計(jì)劃而誕生的一項(xiàng)新技術(shù)。它是由 Southern印跡技術(shù)衍生而來(lái)，是一門多學(xué) 個(gè) 交叉 的綜合技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)涉及到了生 命科學(xué)、計(jì)算機(jī)、微機(jī)械、微電子、物理 、化學(xué)、數(shù)學(xué)等領(lǐng)域。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 定義：

2、通過 微加工 和 微電子 技術(shù)，在 固相 基質(zhì) 表面 集成 了成千上萬(wàn)密集排列的分子 微陣列 ，以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織，細(xì)胞，核酸，蛋 白質(zhì)及其他生物分子進(jìn)行有效、準(zhǔn)確、 高 通量 的檢測(cè)。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 章節(jié)提要 種類： 基因 芯片、 蛋白質(zhì) 芯片、 組織 芯片 、 液相 芯片、 縮微 芯片實(shí)驗(yàn)室。 各類芯片的定義。 最終 目標(biāo) ：把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所涉及的 樣品制備，生化反應(yīng)和檢測(cè)分析的整個(gè)過 程集成化，并縮微到一張芯片上自動(dòng)完成 ，形成 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 。 章節(jié)提要 章節(jié)提要 芯片技術(shù)的

3、優(yōu)點(diǎn)： 多樣品并行 處理、分析 速度快 、所需樣品 量少 、 污染少 。 應(yīng)有的領(lǐng)域：基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物 篩選，指導(dǎo)用藥與治療、農(nóng)作物優(yōu)育優(yōu)選 、環(huán)境檢測(cè)、衛(wèi)生監(jiān)督、司法鑒定。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 以結(jié)構(gòu)與工作機(jī)制可分為 微陣列 芯片與 微 流體 芯片 微陣列芯片：由生物材料 微陣列構(gòu)成 的芯 片，以分子間的 親和結(jié)合 作為核心，以在 固相載體表面 固定 一系列 可尋址 的識(shí)別分 子陣列為結(jié)構(gòu)特征，如 堿基配對(duì)，抗原抗 體結(jié)合 ，包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組 織芯片等。 Zhejiang Pro

4、vincial Key Lab of Medical Genetics 章節(jié)提要 微流體芯片：以 微管道網(wǎng)絡(luò) 為結(jié)構(gòu)特征 ， 實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生化組分的 微流控操作 和分析 ， 包括 毛細(xì)管電泳 芯片 ， PCR反應(yīng) 芯片等 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室優(yōu)勢(shì)：將樣品制備 、 生化 反應(yīng) 、 檢測(cè)等過程 集成在一個(gè)系統(tǒng) 中 。 它 是未來(lái)芯片發(fā)展的 主流方向 之一 ， 也是生 物芯片發(fā)展的 最終目標(biāo) 。 章節(jié)提要 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 本章節(jié)主要的學(xué)習(xí)內(nèi)容 基因芯片 （ gene chip） 蛋白質(zhì)芯片 （ prote

5、in chip） 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 （ laboratory on a chip） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第一節(jié) 基因芯片 基因芯片 (gene chip)又稱 DNA芯片（ DNA chip）或 DNA微陣列（ DNA microarray）。 將 大量的 基因片段 有序地 、 高密度地 排列 在玻璃片或纖維膜等 載體上 ，稱之為基因 芯片。 DNA Microarray 的原理 經(jīng)過標(biāo)記的待測(cè)樣品 DNA通過與芯片上特 定位置的探針按 堿基配對(duì) 原理雜交后，經(jīng) 激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行

6、 掃 描 ，通過檢測(cè)雜交信號(hào) 強(qiáng)度 來(lái)獲取樣品分 子的 數(shù)量 與 序列信息 ，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行 數(shù)據(jù) 比較與分析 ，從而對(duì)基因序列及功能 進(jìn)行大規(guī)模，高通量的 研究 。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 一、基因芯片的原理 基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè) 序技術(shù)上的一種 高效、快速 核酸序列分析手段。 同時(shí)也是 最先發(fā)展 ， 最為成熟 ， 最先商品 化 的生物芯片 芯片分類 載體不同：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、 陶瓷芯片 方法不同：原位合成、直接點(diǎn)樣 探針不同：寡核苷酸、

7、cDNA、基因組芯片 用途不同：表達(dá)譜、測(cè)序芯片、診斷芯片 、 SNP分型 分析步驟為： 生物芯片的 制作 、樣品 處理及標(biāo)記 、雜交或 反 應(yīng) 、雜交 檢測(cè) 及 數(shù)據(jù) 處理等。 芯片設(shè)計(jì) 芯片制作 PCR擴(kuò)增 靶基因標(biāo)記 原位合成 點(diǎn)樣方法 實(shí)際應(yīng)用 樣品處理 芯片雜交 數(shù)據(jù)分析 雜交檢測(cè) 放射顯影光 化學(xué)電化學(xué) 酶促反應(yīng) 芯片技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵 無(wú)孔的 固相載體 ，如玻璃 高密度寡核苷酸片段的 原位合成 技術(shù) Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 載體的定義與種類 定義：用于 連接、吸

8、附或包埋 各類生物分 子使其以 水不溶性狀態(tài) 行使功能的 固相材 料 。 玻片 固體片狀 硅片 瓷片 硝酸纖維素膜 膜性材料 尼龍膜 聚丙烯膜 具有可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的 活性基團(tuán) ，便于 與生物分子進(jìn)行 偶聯(lián) 。 要有 惰性與穩(wěn)定性 ：惰性（非特異吸附和 其他性能不干擾生物分子的動(dòng)能）穩(wěn)定性 （能承受一定的壓力與酸堿條件的變化） 良好的 兼容性 (便于制作其他類型的芯片 ) 載體材料的要求 載體的表面處理 原因 ：核苷酸片段 無(wú)法直接 連接到載體表 面

9、，故 需要活化 ，便于固定生物分子。 試劑 ：碳二亞氨， N-羥基琥珀酰亞胺酯。 活性基團(tuán) ：氨基、羥基、巰基、醛基 處理依據(jù) ：載體表面性質(zhì)、生物分子的化 學(xué)特征 常見載體 薄膜狀載體 優(yōu)點(diǎn)：與核酸親和力強(qiáng)、技術(shù)成熟。 膜結(jié)合玻璃片 優(yōu)點(diǎn)：親和性、剛性 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 處理載體的基本要求 修飾后表面要 均勻且硬質(zhì) 有效固定 各種類型 生物材料 在激發(fā)光下，熒光 背景低 高密度 ， 大量 ， 均勻 的點(diǎn)陣， 變異系數(shù)小 Zhejiang Provi

10、ncial Key Lab of Medical Genetics 探針固定到固相支持物上，方法有兩種： 光去保護(hù)并行合成法 原位合成 分子印章原位合成法 噴印合成法（壓電打印法） 合成點(diǎn)樣 通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接將探針點(diǎn) 在芯片上的技術(shù)。 合成 cDNA探針的原則 設(shè)計(jì)于目的 cDNA的 3端。 避免長(zhǎng)片段重復(fù)序列 長(zhǎng)度為 0.1-2.5kb Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 寡核苷酸探針 長(zhǎng)度 16-26bp， G+C在 40-60%

11、 探針內(nèi)不用大于 4bp的堿基互補(bǔ)配對(duì)序列， 同一個(gè)堿基連續(xù)出現(xiàn)小于 4個(gè) 與非靶序列的同源性低于 70%，小于 8個(gè)堿 基相同。 設(shè)置多個(gè)序列相近的參考寡核苷酸探針。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 點(diǎn)突變檢測(cè)核苷酸探針 設(shè)計(jì)方法：等長(zhǎng)移位設(shè)計(jì)法 按靶序列從頭到尾依次去一定長(zhǎng)度的互 補(bǔ)的核苷酸序列組成的一套探針組合。這 套探針是野生型探針，然后對(duì)每一野生型 探針中間的某一堿基用其他三種堿基替代 。 主要目的：進(jìn)行點(diǎn)突變掃描 Zhejiang Provincial Key Lab of Medi

12、cal Genetics 探針在載體表面的固定（一） 合成點(diǎn)樣法：通過 PCR擴(kuò)增或人工 合成 序 列，通過計(jì)算機(jī)控制的三坐標(biāo)工作平臺(tái)， 用針頭和微噴頭分別把探針溶液 分配 在固 相載體表的位點(diǎn)上，通過物理或化學(xué)法 固 定 探針。 優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)成熟，靈活性大，適用于單位 自行合成 。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 在硬質(zhì)表面上直接合成寡核苷酸探針序列 原位光刻合成法、壓電打印合成法，分子 原位合成法。 技術(shù)瓶頸：高空間分辨率的模板點(diǎn)位技術(shù) 、高合成效率的 DNA化學(xué)合成技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化，規(guī)模化 Zhe

13、jiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針在載體表面的固定（二） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 原位合成的原理 基因芯片的原位合成法是基于 組合化學(xué) 的 合成原理。 它通過一組 定位模板 來(lái)決定基片表面上不 同化學(xué)單體的 偶聯(lián)位點(diǎn)和次序 ，如要合成 AGCT四種堿基所有序列組合的四聚體 (44 種 )。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 原位光刻合成法 主要步驟為： 1.首先用光敏保護(hù)支持物活化基團(tuán)

14、 2.選擇合適的蔽光膜保護(hù)不需要聚合的地方，暴露 需要聚合的位點(diǎn) 3.在激光點(diǎn)光源的照射下，去除光敏感保護(hù)基團(tuán)， 使該位點(diǎn)顯露出活性的羥基或者氨基 4.加入的單核苷酸，與活化端發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 5.然后更換蔽光膜，重復(fù)上步驟，完成核苷酸的固 定連接（見圖）。 優(yōu)點(diǎn)： 在 較小的區(qū)域制造大量不同的探針 。 圖 9-2基因芯片原位合成原理示意圖 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 噴印合成法（壓電打印法） 原理： 墨盒內(nèi)所用的 ATCG四種堿基而非碳粉。 步驟： 將特定的 DNA堿基合成試劑噴灑到

15、特定 位置上，以固相合成的原理與支持物發(fā)生偶 聯(lián)，然后固定，沖洗，去保護(hù)，偶聯(lián)，直至 合成完所需長(zhǎng)度的探針。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分子印章原位合成法 分子印章的制備和壓印過程如見圖 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （三）合成點(diǎn)樣 由具有多個(gè)微細(xì)加樣孔的陣列復(fù)制器 (arraying and replicating device， ARD)或陣列器及由電 腦控制的機(jī)器人來(lái)完成。 機(jī)器人準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量 (0.25 1.0l)點(diǎn)

16、樣于預(yù)處理好的基板相應(yīng)位置上，在基板 上產(chǎn)生直徑為 100 150m斑點(diǎn)，再由紫外線交 聯(lián)固定后即得到 DNA微陣列或芯片。 合成點(diǎn)樣法分類 接觸式點(diǎn)樣 噴墨式打印 定位準(zhǔn)確，重復(fù)性好 斑點(diǎn)大，大小分布不均，密度低。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 二、樣品的制備 及標(biāo)記 （一）樣品的制備 樣品的 擴(kuò)增 在標(biāo)記和分析前對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)程度的擴(kuò) 增，以提高閱讀靈敏度。 待測(cè)樣品的 標(biāo)記 多采用熒光標(biāo)

17、記（ cy3、 cy5和 FAM）方法， 對(duì)于陣列 密度較小 的基因芯片可以用 同位 素 檢測(cè)法。 熒光標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn) 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的 STOCKs位移 大，故分辨率強(qiáng)，靈敏度高 可以進(jìn)行定量檢測(cè) 避免放射性同位素好的污染。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三 樣品與基因芯片的雜交 本質(zhì) ： DNA探針與靶基因堿基雜交形成 DNA雙鏈或 DNA/RNA雜合鏈。 影響因素 ： 靶分子濃度 探針濃度 序列組成 鹽濃度 雜交溫度 反應(yīng)時(shí)間 基因表達(dá) 檢測(cè) 低溫，高鹽，長(zhǎng)時(shí)間

18、 突變 檢測(cè) 高溫，低鹽，短時(shí)間 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 四、雜交結(jié)果的檢測(cè) 檢測(cè)方法很多，如 熒光顯影法 、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā) 光和光導(dǎo)纖維等。 熒光檢測(cè)器 激光共聚焦 快速傳輸 高質(zhì)量圖像，靈敏度高， 分辨率好 價(jià)格昂貴 偶聯(lián)裝置照相機(jī) 掃描速度快，價(jià)格便宜 靈敏度低 熒光顯影法 完全匹配產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比存在一兩個(gè)錯(cuò) 配的 高 5-35倍 熒光 強(qiáng)度 與待測(cè)分子的 含量呈線性 關(guān)系 問題 只要結(jié)合就會(huì)有陽(yáng)性信號(hào)， 無(wú)法 確認(rèn)是否 完全匹配 解決方

19、法 使用多色熒光技術(shù) 不同靶基因使用不 同激發(fā)波長(zhǎng)的熒光標(biāo)記物。 芯片 激光光源 電子束分裂器 聚焦小孔 檢 測(cè) 器 濾光鏡 聚光鏡 物鏡 使用最廣泛的是熒光顯影法 光纖 DNA生物傳感器微陣列 原理： 將合成的 氰尿酰氯 活化的 探針固定在光 纖 的末端， 集成 含有不同探針的光纖，形成 傳感裝 置，探針伸入樣品中，信號(hào)由另一端 的 CCD檢測(cè) 。 優(yōu)勢(shì) 方便，可在沒有 confocal的實(shí)驗(yàn)室中開展 實(shí)驗(yàn)。 五、雜交結(jié)果的分析 標(biāo)準(zhǔn)化 ：消除不同芯片，不同標(biāo)記物的差 異 數(shù)據(jù)精簡(jiǎn) ：去掉無(wú)顯要意義的數(shù)據(jù) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ：對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行

20、分析歸類，并進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，保證器準(zhǔn)確性 生物學(xué)意義分析 ：基于統(tǒng)計(jì)結(jié)果，研究其 代表的生物學(xué)意義，得出相應(yīng)結(jié)論 數(shù)據(jù)庫(kù) ： Genesist， AMADA， TIGR。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三、基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 基因芯片技術(shù)的基本應(yīng)用可以分為兩個(gè)主 要方面： 定量分析 （主要指測(cè)序和突變檢測(cè)） 定性分析 （主要指對(duì)基因表達(dá)的研究）。 基因功能研究 基因表達(dá)及調(diào)控的研究 基因突變和多態(tài)性的檢測(cè) DNA序列的測(cè)定 基因組及基因研究 基因表達(dá)及調(diào)控的研究

21、 基因芯片應(yīng)用 最廣泛的領(lǐng)域 從 整體上 分析細(xì)胞基因表達(dá)狀況，為了解 與某些生命現(xiàn)象相關(guān)的基因表達(dá)提供有力 的 證據(jù) ，對(duì)于 基因調(diào)控 以及基 因相互作用 機(jī)理的探討有重要的意義 基因突變和多態(tài)性的檢測(cè) 利用基因芯片技術(shù)對(duì)一些突變點(diǎn)的 定位 、 確認(rèn)及分類 是診斷基因疾病的基礎(chǔ)。 寡核苷酸芯片能夠檢出變異位點(diǎn)，被代替 的核苷酸以及變異的特性。 例如： HIV病毒 RT與 PRO的突變檢測(cè)。 DNA序列測(cè)定 原理：任何線性 DNA或 RNA單鏈都可以被 分解為一系列堿基數(shù)固定，錯(cuò)落重疊的寡 核苷酸片段，或稱為 亞序列 ，只要測(cè)出莫 伊核苷酸的全部亞序列，就可以還原

22、原序 列。 優(yōu)點(diǎn) 快速、成本低、易于自動(dòng)化 缺點(diǎn) 雜交條件 不統(tǒng)一 、易出現(xiàn) 假性 結(jié)果、 重復(fù)序列 無(wú)法測(cè)定 。 優(yōu)勢(shì) 測(cè)定已知序列、研究突變與 SNP檢 測(cè)。 基因組及基因研究 研究酵母基因組的復(fù)制活動(dòng)：發(fā)現(xiàn)其復(fù)制 起點(diǎn)、復(fù)制叉在基因組的移動(dòng)與 S期復(fù)制和 轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的關(guān)系 優(yōu)勢(shì)： 用量少、自動(dòng)化、便于大量篩選新 基因 基因芯片應(yīng)用于疾病診斷的 優(yōu)勢(shì) 靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單、高通量（同時(shí) 檢測(cè)多種疾?。? 應(yīng)用： 感染性 疾病診斷 出生缺陷檢測(cè) 遺傳性 疾病的診斷 HLA配型檢測(cè) 腫瘤 診斷及分型

23、神經(jīng)系統(tǒng)疾病檢測(cè) 耐藥 性檢測(cè) 疾病診斷 感染性疾病診斷 流程 將待測(cè)病原體的 特征基因 片段或寡核苷 酸探針固定于玻片上制成芯片 ， 從患者的 血清中提取的 病原 DNA或 RNA經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記 熒光后與芯片進(jìn)行 雜交 ， 掃描 雜交信號(hào) ， 計(jì)算機(jī) 分析 ， 得出 定性或定量 的結(jié)果 。 由于病原微生物的不同 亞型 ，不同的 突變 株 會(huì)導(dǎo)致患者的 發(fā)病 程度，患者對(duì)藥物的 敏感 程度等的差異，故對(duì)病原微生物的分 型，可以幫助醫(yī)生了解患者的病情，確定 最佳治療 方案。 如 HPV亞型 123種，其中 20種高危，提前診 斷 HPV感染，有利于防止宮頸癌變，降低

24、 死亡率?；蛐酒贤瑫r(shí)對(duì) 21種不同類型 的 HPV診斷， 3.5小時(shí)完成。 感染性疾病診斷 遺傳性疾病的診斷 現(xiàn)行診斷遺傳學(xué)疾病方法（ PCR，測(cè)序、 RFLP）的 共同缺點(diǎn)通量低 。 遺傳性疾病中可能是由眾多位點(diǎn)中的一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)突變引起的，因此對(duì)多位點(diǎn)檢 測(cè)尤為重要。 如 beta-地中海貧血，突變 100種以上。 應(yīng)用于血友病，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、苯丙 酮尿癥，血紅蛋白異常病。 腫瘤診斷及分型 獲取腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)各期與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān) 基 因的表達(dá)模式 篩選出哪些分子起關(guān)鍵性的調(diào)控作用的基 因 腫瘤分型 （乳腺癌） 應(yīng)用如 p53基因突變檢測(cè) 耐藥性

25、檢測(cè) 病原微生物的 表達(dá)譜 檢測(cè) 突變 分析 多態(tài)性 分析 目的 指導(dǎo) 抑制靶分子的新藥合成、臨 床用藥 基因芯片在藥物研究中的應(yīng)用 可直接在基因水平上 尋找藥物靶標(biāo) ， 解釋 作用機(jī)理 ， 檢測(cè) 藥物的 毒副作用 ，為藥物 開發(fā)與設(shè)計(jì) 提供理論依據(jù) 。 作用體現(xiàn) ： 代替人體的靶組織 分析代謝途徑與信號(hào)通路 確定藥物作用的靶組織 引導(dǎo)藥物開發(fā) 縮短周期，便捷 基因芯片存在的問題 探針合成中會(huì) 插入雜質(zhì) ， 降低特異性 制備標(biāo)記 過程比較 復(fù)雜 。 數(shù)據(jù) 缺乏可比性 ，不利于芯片 數(shù)據(jù)的共享 產(chǎn)生原因： 蛋白質(zhì)的表達(dá)與其上游的 mRN

26、A的表達(dá) 未顯 示出直接關(guān)系 。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象的 微小變化 均能導(dǎo)致其活 性與 功能的改變 定義：是指固定于支持介質(zhì)上的 多肽或蛋白 質(zhì) 構(gòu)成的微陣列 第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片 第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片 第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種 快捷、高效、并行、 高通量、微型化和自動(dòng)化 的蛋白質(zhì)分析技 術(shù)。 蛋白質(zhì)芯片適用于 蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì) - DNA、蛋白質(zhì) -RNA、蛋白質(zhì) -小分子物質(zhì) 間 相互作用的分析。 是功能基因組、蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域中一種

27、 新型的 重要工具。 蛋白質(zhì)芯片 原理：采用 機(jī)械點(diǎn)樣或共價(jià)結(jié)合 等方法將 多肽、蛋白質(zhì)、酶、抗原或抗體 固定于 固 相載體上形成 分子點(diǎn)陣 ，并將待測(cè)蛋白質(zhì) 與該芯片進(jìn)行 孵育反應(yīng) ，再將 熒光標(biāo)記 的 蛋白質(zhì)與芯片 蛋白質(zhì)復(fù)合物反應(yīng)。通 過掃描系統(tǒng)檢測(cè)個(gè)點(diǎn)的 熒光強(qiáng)度 ，分析蛋 白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，由此達(dá)到 測(cè)定蛋白功能 的目的。 蛋白質(zhì)芯片的分類 蛋白質(zhì)功能芯片 天然蛋白質(zhì) 點(diǎn)在基片上，用于蛋白 活性 及分子 親和性 的高通量平行分析。 蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片 將高度親和特異性的探針分子（ mAb） 點(diǎn)在基片上，用以檢測(cè)復(fù)雜樣品中 目的蛋白 。 蛋白

28、質(zhì)芯片的分類 1. 支持物表面高度密集排列探針蛋白 點(diǎn)陣 微陣列 微孔板 測(cè)定時(shí)，特異性地捕獲樣品中的靶蛋白， 然后通過檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性及定量 分析?？贵w為常用的探針蛋白。 2. 三維凝膠 塊芯片 實(shí)質(zhì)是在基片上點(diǎn)布以 10000個(gè)微小 PAGE膠塊，主要用于篩選抗體抗原，酶動(dòng) 力學(xué)反應(yīng)的研究。 優(yōu)點(diǎn)： 靈敏、蛋白結(jié)構(gòu)天然 蛋白質(zhì)芯片的制備與分析 載體 探針蛋白的制備 探針的固定 檢測(cè) 載體 要求： 穩(wěn)定性，兼容性 種類： 化學(xué) 膜 尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜 無(wú)需復(fù)雜的表面處理

29、 背景高，靈敏度低 PAGE膠 儲(chǔ)水環(huán)境 保持探針活性，除反應(yīng)液困 難 微孔 板 性能良好，探針分隔良好 交叉污染程度 低，液相 保持探針活性 玻 片 為最佳載體 需表面修飾（醛基、 BSA、 poly- lysine） 高通量 自動(dòng)化 效率高 探針的制備 種類：抗體、抗原、蛋白質(zhì)、配體、受體 、酶、核酸、多肽 要求：親和性強(qiáng)、特異性高。 應(yīng)用最廣泛的探針：抗體，抗原，尤其是 mAb Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針蛋白的制備 蛋白質(zhì)芯片上的探針蛋白可選用抗體、 抗原、受體、酶等具有生物活性

30、的蛋白 質(zhì)。單克隆抗體是比較好的一種探針蛋 白。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 探針的固定 體外合成 的劣勢(shì) 多肽長(zhǎng)度不易控制、探針活性位置 點(diǎn)加法 ： 手工點(diǎn)樣 接觸式點(diǎn)樣 噴墨點(diǎn)樣法 固定后，需用 BSA溶液封閉 提高特異性 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （四）蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè) 1.直接檢測(cè)法 表面等離子體共振 分辨熒光光譜技術(shù) 表面增強(qiáng)激光解吸及電離飛行時(shí)間質(zhì) 譜 2.蛋白質(zhì)標(biāo)記法 預(yù)先標(biāo)記待測(cè)物，

31、常用標(biāo)記物有熒光染料 cy3,cy5，也可標(biāo)記蛋白質(zhì)的二抗 優(yōu)勢(shì)：原理簡(jiǎn)單，使用安全，分辨率高 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 四、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用 優(yōu)勢(shì) 高通量 靈敏度高 用量少 應(yīng)用 （一）疾病診斷與療效判定 （二）新藥的研制與開發(fā) （三）蛋白質(zhì)研究方面的應(yīng)用 疾病診斷與療效判定 表型指紋 同時(shí)測(cè)定樣品中 全部蛋白含量 的變化 優(yōu)勢(shì) 不受單個(gè) 標(biāo)志物的特異性與靈敏度的 限制 應(yīng)用 腫瘤 C12診斷系統(tǒng) 自免疫疾病 抗原檢測(cè) 新藥的研制與開發(fā) 用芯片找到病理狀態(tài)下 表達(dá)異?；蛱禺愋?/p>

32、 表達(dá) 的蛋白質(zhì)及通路中 關(guān)鍵蛋白 ，以這些 蛋白為 靶分子 ，合成芯片，研究藥物對(duì)這 些蛋白的作用。 優(yōu)勢(shì) 節(jié)約時(shí)間，減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，降低盲目性 生物分子間的相互作用 抗原 -抗體相互作用 蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用 小分子 -蛋白質(zhì)相互作用 蛋白質(zhì) -核酸相互作用 酶 -底物相互作用 蛋白質(zhì)芯片 應(yīng)用 蛋白芯片的缺陷 制作 繁瑣 ，檢測(cè)需 專門的儀器 ， 成本高 載體表面修飾技術(shù)，探針固定 技術(shù)需改進(jìn) 不能捕獲 全部 蛋白質(zhì)信息 實(shí)驗(yàn) 要求高 ，不易控制， 重復(fù)性不足 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 第三節(jié) 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室就是將生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研 究中的 許多不連續(xù)的分析過程 ，如樣品制 備、核酸標(biāo)記、生化反應(yīng)、分離檢測(cè)及數(shù) 據(jù)處理等，通過采用半導(dǎo)體光刻加工等縮 微技術(shù)， 集成到一塊生物芯片 上所形成的 一種便攜式 生物化學(xué)分析系統(tǒng) 。 特點(diǎn) 集成實(shí)驗(yàn)單元 時(shí)間短 速度快 信息量 大 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 高度集成化 體積小 自動(dòng)化 重量輕 高通量 便于攜帶 分析速度快 污染小 樣品量少 成本低 Lab on a chip Lab on a chip