《基因工程概述》PPT課件

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1、（ ) （ ; qxt-） 現(xiàn)代生物技術(shù)是解決人類面臨的困境的有效途徑 基 因 工 程 的 地 位發(fā)酵工程 細胞工程酶工程 蛋白質(zhì)工程 基 因 工 程 常 用 生 物 技 術(shù) 舉 例 干 細 胞 技 術(shù) ： 恩 同 再 造 ， 無 論 換 器 官 還 是 重 生 。 基 因 治 療 ： 遺 傳 物 質(zhì) 的 局 部 改 變 ， 亟 待 提 高 安 全 性 。 哺 乳 動 物 體 細 胞 克 隆 技 術(shù) ： 開 啟 了 一 個 人 類 無 法 預(yù) 知 的 克 隆 人 的 大 門 ， 是 福 是 禍 ？ 全 基 因 組 測 序 ： 遺 傳 天 書 編 排 才 開 始 ， 讀 懂 它 尚 需 時 日

2、。 單 克 隆 抗 體 技 術(shù) ： 細 胞 全 能 性 和 細 胞 融 合 技 術(shù) 的 完 美 結(jié) 合 。 . 干 細 胞 技 術(shù) 基 因 治 療 技 術(shù) 1997年 多 利 羊 誕 生 使 體 細 胞 克 隆 哺 乳 動 物 成 為 可 能 多利和它的孩子 人 類 基 因 組 計 劃 -人 類 基 因 的 破 解 基因工程- 現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的核心，是基因乾坤大轉(zhuǎn)移和大融合的技術(shù) 基 因 工 程 應(yīng) 用 微 生 物 發(fā) 酵 ： 制 備 工 業(yè) 原 料 、 食 品 添 加 劑等 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) ： 動 植 物 營 養(yǎng) 品 質(zhì) 改 良 ， 提 高 抗逆 性 醫(yī) 藥 業(yè) ： 基 因 工 程 制 藥

3、（ 抗 生 素 、 疫 苗 、抗 體 等 ） 軍 事 ： 生 物 武 器 航 天 ： 提 高 生 物 耐 缺 氧 、 耐 輻 射 等 性 狀 。 ACC合 成 酶利 用 反 義 RNA技 術(shù) ， 抑 制 乙 烯 合 成 的 前 體耐 貯 運 對 于 番 茄 、 草 莓 、 香蕉 、 蘋 果 等 果 蔬 最 為 重 要 這些東西最好也不要出現(xiàn)！ 微生物基因工程 轉(zhuǎn) 基 因 植 物 番 茄 子 葉 分 化 轉(zhuǎn) 基 因 番 茄 的 移 栽 田 間 生 長 與 結(jié) 實 ELISA檢 測 轉(zhuǎn) 基 因 植 株 HBsAg活 性 轉(zhuǎn) 基 因 番 茄 的 PCR鑒 定 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 在 轉(zhuǎn)

4、基 因 番 茄 中 的 表 達 體細胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動物的基本過程 胚胎干細胞的篩選和細胞移植培育轉(zhuǎn)基因動物的基本過程 轉(zhuǎn) 基 因 動 物 工 具 酶 的 總 結(jié) 克 隆 載 體 載 體 （ Vector） 的 概 念 添 加 復(fù) 制 起 始 位 點 、 啟 動 子 和 轉(zhuǎn) 錄 終 止 子可 以 解 決 “ 單 獨 ” 的 外 源 基 因 在 宿 主 細 胞 內(nèi) 不能 復(fù) 制 表 達 甚 至 被 降 解 的 “ 杯 具 ” 。 這 一 需求 催 生 了 -載 體 。 載 體 是 攜 帶 外 源 基 因 在 宿 主 細 胞 內(nèi) 完 成 的復(fù) 制 甚 至 表 達 人 工 構(gòu) 建 的 DNA分 子

5、 。 載 體 的 分 類根 據(jù) 用 途 可 以 分 為 ： 克 隆 載 體 ： 在 宿 主 細 胞 內(nèi) 高 保 真 地 大 規(guī) 模復(fù) 制 。測 序 載 體 ： 用 于 測 定 DNA序 列 。表 達 載 體 ： 用 于 外 源 基 因 的 表 達 。盡 管 如 此 ， “ 三 合 一 ” 的 載 體 目 前 經(jīng) 常 用 。根 據(jù) 來 源 不 同 可 以 分 為 ：質(zhì) 粒 載 體 ， 病 毒 載 體 ， 人 工 染 色 體 載 體 的 基 本 條 件1、 能 自 我 復(fù) 制 并 能 帶 動 插 入 的 外 源 基 因 一 起 復(fù) 制 。2、 具 有 合 適 的 多 種 限 制 酶 的 單 一 切

6、 點 。3、 具 有 適 宜 的 篩 選 標 記 。4、 相 對 分 子 質(zhì) 量 小 ， 細 胞 內(nèi) 拷 貝 數(shù) 要 多 。5、 在 細 胞 內(nèi) 穩(wěn) 定 性 高 ， 易 分 離 純 化 。 載 體 結(jié) 構(gòu) 多 克 隆 位 點 ， 容許 外 源 基 因 插 入的 合 法 位 點宿 主 細 胞 能 識 別的 復(fù) 制 起 始 序 列 ，如 果 含 有 兩 種 以上 復(fù) 制 起 始 位 點 ，則 為 穿 梭 載 體 篩 選 標 記 ： 抗 生 素 分 解 基 因（ Amp, Km等 ） 、 報 告 基 因（ GUS, GFP, LUC,LacZ） 。這 些 基 因 多 為 組 成 型 啟 動 子控 制

7、 ， 恒 定 表 達 。 啟 動 子 （ 宿 主 細胞 能 識 別 的 啟 動子 ） 終 止 子 （ 轉(zhuǎn) 錄 終止 序 列 ， 多 來 自宿 主 細 胞 病 毒 和細 菌 ） 體 外 重 組重 組 DNA向 宿 主 細 胞 導(dǎo) 入 Recombinant DNA 重 組 重 組 是 通 過 T4 DNA連 接 酶 將 目 的 DNA片 段 插 入到 載 體 相 應(yīng) 位 點 的 DNA重 組 過 程 。 通 過 優(yōu) 化 連 接參 數(shù) 可 以 獲 得 高 的 連 接 效 果 。 具 體 如 下 ： 1 . 插 入 片 段 摩 爾 數(shù) 要 多 于 載 體 摩 爾 數(shù) （ 3 -1 0 倍 ） ； 2

8、 . 平 末 端 連 接 采 用 低 溫 （ 4 -8 度 過 夜 ） ， 而 黏 性 末端 在 室 溫 下 連 接 幾 小 時 或 1 6 度 連 接 過 夜 。 3 . 連 接 體 系 一 般 為 1 0 -2 0 微 升 ， 體 積 過 大 過 小 會 影 響連 接 效 率 。4 .可 以 用 T4 RNA 連 接 酶 連 接 單 鏈 的 DNA 分 子 。 體 外 重 組 線 路 圖 導(dǎo) 入 重 組 體 主 要 方 法 物 理 學(xué) 方 法 ： 微 注 射 技 術(shù) 、 基 因 槍 技 術(shù) 、 電 轉(zhuǎn) 化 法 （ 電 穿 孔 術(shù) ） 、 超 聲 波化 學(xué) 方 法 ： CaCl2低 滲 轉(zhuǎn)

9、化 大 腸 桿 菌 、 脂 質(zhì) 體 介導(dǎo) 法 、 PEG介 導(dǎo)生 物 媒 介 方 法 ： 病 毒 介 導(dǎo) 法 、 農(nóng) 桿 菌 介 導(dǎo) 轉(zhuǎn) 基因 方 法 轉(zhuǎn) 化 原 理 負 對 照 實 驗 組 正 對 照 藍 白 篩 選 結(jié) 果 1 根 癌 農(nóng) 桿 菌 介 導(dǎo) 轉(zhuǎn) 化 植 物 的方 法1 . 根 癌 農(nóng) 桿 菌 （ Agrobacterium tumefaciens)的 一 般 性 質(zhì) ： 冠 癭 病 Ti質(zhì) 粒 （ Tumor inducing plasmid) T-DNA (Tramsferred DNA)區(qū) Vir區(qū) * 冠 癭 瘤 的 特 點 ： 激 素 自 主 性 冠 癭 堿 幻 燈

10、片 5 無 正 常 分 化 能 力 * 農(nóng) 桿 菌 與 Ti 質(zhì) 粒 的 類 型 ： 章 魚 堿 型 （ octopine type） 胭 脂 堿 型 （ nopaline type） 農(nóng) 桿 堿 型 （ agropine type） * 冠 癭 堿 可 以 分 為 四 類 ： 章 魚 堿 族 胭 脂 堿 族 甘 露 堿 族 農(nóng) 桿 素 Octopi ne Vi r 基 因 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 A: a.中 間 載 體 必 須 有 T-DNA的 同 源 序 列 ， 還 有 pBR的 序 列 ， 進 入 農(nóng) 桿 菌 后 高 頻 同 源 重 組 b.要 有 細 菌 選 擇 標 記 基

11、因 ， 便 于 篩 選 共 整 合 質(zhì) 粒 c.陽 性 的 這 選 擇 標 記 基 因 d.單 一 的 限 制 內(nèi) 切 酶 切 點 ， 多 克 隆 位 點 e.無 Ti 質(zhì) 粒 的 邊 界 序 列 f.要 有 bom位 點 序 列 ， 可 以 在 不 同 細 菌 細 胞 間 轉(zhuǎn) 移B.二 元 載 體 系 統(tǒng) 的 中 間 載 體 特 點 ： a.無 同 源 序 列 b.有 LB和 RB c.無 cell EI 復(fù) 制 點 T-DNA的 整 個 轉(zhuǎn) 化過 程 缺 失 啟 動 子 -GUS表 達 載 體 轉(zhuǎn) 化 煙 草 對 照 抗 性 芽 （ Km:100ug/ml） 生 根 的 轉(zhuǎn) 基 因 煙 草

12、 苗 （ Km:100ug/ml） 轉(zhuǎn) 化 煙 草 土 培 苗 開 花 的 土 培 苗 電 轉(zhuǎn) 化 法 （ electrotransfortion） 也 稱 電 穿 孔 術(shù) （ electroporation） ,是 利 用 高 壓脈 沖 瞬 時 放 電 ， 使 電 場 中 的 細 胞 膜 穿 孔 ， 位 于 溶液 中 的 外 源 基 因 得 以 進 入 細 胞 。 影 響 轉(zhuǎn) 化 率 的 因素 很 多 ， 如 ： 電 場 強 度 、 電 脈 沖 的 長 度 、 DNA的 構(gòu) 象 和 濃 度 、 培 養(yǎng) 液 的 離 子 成 分 等 ， 需 摸 索 反應(yīng) 條 件 ， 優(yōu) 化 各 項 參 數(shù) 。

13、當(dāng) 電 場 強 度 和 脈 沖 長 度以 一 定 方 式 組 合 而 導(dǎo) 致 50 70 細 胞 死 亡 時 ，轉(zhuǎn) 化 的 水 平 達 到 最 高 。 特 點 ： 無 受 體 細 胞 特 異 性 ， 動 、 植 物 細 胞 ， 原 核細 胞 均 可 ； 轉(zhuǎn) 化 率 不 穩(wěn) 定 ， 需 摸 索 確 定 轉(zhuǎn) 化 條 件； 具 有 成 套 專 用 設(shè) 備 。 示意電激轉(zhuǎn)化 微 注 射 技 術(shù) （ microinjection） 用 微 吸 管 吸 入 供 體 DNA溶 液 ， 在顯 微 鏡 下 準 確 插 入 受 體 細 胞 核 中 ，并 將 DNA注 射 進 去 。特 點 ： 多 用 于 動 物

14、細 胞 ； 注 射 過 程 慢 ，技 術(shù) 要 求 高 ； 有 成 套 專 用 設(shè) 備 。 DNA顯 微 注 射 示 意 圖 圖示微注射轉(zhuǎn)化的應(yīng)用 基 因 槍 技 術(shù) （ geneblaster technique） 利 用 一 個 高 速 推 動 力 ， 加 速 重 金 屬 粒子 運 動 ， 使 附 著 在 重 金 屬 粒 子 上 的 外 源DNA隨 同 重 金 屬 粒 子 一 起 射 入 靶 細 胞 或 組織 內(nèi) 。 一 般 把 DNA包 被 在 金 粒 或 鎢 粒 上 ，用 彈 藥 槍 （ 化 學(xué) 推 進 劑 為 動 力 ） 和 電 子 槍（ 以 放 電 為 動 力 ） 為 工 具 將 粒

15、 子 向 受 體 細胞 轟 擊 。特 點 ： 無 宿 主 特 異 性 ； 能 直 接 向 細 胞 器 中 輸 入DNA； 轉(zhuǎn) 化 有 壁 的 植 物 細 胞 有 效 ； 已 有 多 種 類 型基 因 槍 可 供 選 用 ， 還 在 不 斷 改 進 和 發(fā) 展 。 脂 質(zhì) 體 介 導(dǎo) 法 （ liposome mediated gene transfer） 脂 質(zhì) 體 （ liposome 人 工 膜 泡 ） 是 由 脂 質(zhì)雙 分 子 層 組 成 的 環(huán) 形 封 閉 囊 泡 ， 無 毒 、 無免 疫 原 性 。 在 體 外 ， 脂 質(zhì) 體 作 為 基 因 載 體可 將 基 因 轉(zhuǎn) 化 到 細 菌

16、 、 真 菌 、 植 物 原 生 質(zhì)體 和 動 物 細 胞 。 利 用 脂 質(zhì) 體 導(dǎo) 入 基 因 ， 一般 都 要 將 DNA或 RNA包 囊 于 脂 質(zhì) 體 內(nèi) ， 然后 進 行 脂 質(zhì) 體 與 細 胞 膜 的 融 合 ， 通 過 融 合導(dǎo) 入 細 胞 。 圖示脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 篩 選 概 述 篩 選 是 從 眾 多 轉(zhuǎn) 化 子 中 鑒 定 出 含 有 目的 DNA片 段 的 陽 性 克 隆 的 過 程 。 具 體 的篩 選 程 序 為 ： DNA導(dǎo) 入 宿 主 細 胞 抗 性 篩 選 ,報 告 基因 ， 營 養(yǎng) 缺 陷 篩 選 轉(zhuǎn) 化 子 藍 白 篩 選 重 組 轉(zhuǎn) 化 子 PCR篩 選

17、 , 核 酸 分 子 雜 交 ，免 疫 選 篩 選 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子 測 序 陽 性 克隆 目的基因在哪里？ 獲 得 目 的 基 因 的 策 略 1 .化 學(xué) 直 接 合 成 （ 短 基 因 ， 有 錢 ） 。 2 .同 源 基 因 RT-PCR(或 PCR)直 接 獲 得 （ 全 或 部 分 序 列 已 知 ）。 3 .文 庫 篩 選 法 (構(gòu) 建 一 個 高 質(zhì) 量 的 通 用 文 庫 ， 采 用 核 酸 雜 交或 免 疫 學(xué) 篩 選 基 因 )。 4 .從 蛋 白 質(zhì) 出 發(fā) 的 目 的 基 因 （ 蛋 白 質(zhì) N端 序 列 測 序 ， 隨 后設(shè) 計 兼 并 引 物 聯(lián) 合 RT-PC

18、R） 。 5 .電 子 克 隆 （ 基 于 數(shù) 據(jù) 庫 ， 步 步 為 營 ） 6 .全 基 因 組 測 序 后 預(yù) 測 （ 結(jié) 合 表 達 譜 芯 片 可 以 高 通 量 獲 得表 達 發(fā) 生 變 化 的 目 的 基 因 種 類 及 其 相 對 變 化 水 平 ） 。 元 件 基 因 元 件 組 裝 成 基 因 載 體 元 件 多 克 隆 位 點 克 隆 元 件 銜 接 物 或 人 工 接 頭引 物 測 序 或 PCR探 針 核 酸 分 子 雜 交 用 化 學(xué) 合 成 基 因 序 列 已 知 同 源 蛋 白 基 因 文 庫 是 將 某 一 物 種 基 因 組 DNA或 cDNA以克 隆 的

19、方 式 （ 質(zhì) 粒 或 噬 菌 體 ） 保 存 在 大腸 桿 菌 中 的 方 式 。 構(gòu)建cDNA 文庫 文 庫 篩 選 免 疫 學(xué) 篩 選 目 的 基 因 表 達 目 的 基 因 在 宿 主 細 胞 中 的 表 達 需 具 備 如 下 幾 個 特 點 ： 1 .完 整 的 表 達 框 （ 啟 動 子 -核 糖 體 結(jié) 合 位 點 -目 的 基 因 -標 簽 -轉(zhuǎn) 錄 終 止 子 ）。 其 中 選 擇 組 成 型 、 組 織 器 官 特 異 性 、 發(fā) 育 特 異 性 和 環(huán) 境誘 導(dǎo) 型 啟 動 子 可 以 控 制 目 的 基 因 的 特 殊 表 達 模 式 的 需 求 。原 核 表 達 需

20、 要 用 SD序 列 作 為 核 糖 體 結(jié) 合 位 點 ， 而 真 核 表 達需 要 有 帽 子 位 點 即 可 。 2 . 控 制 表 達 水 平 ， 盡 量 減 少 蛋 白 產(chǎn) 物 對 宿 主 細 胞 的 正 常 生 活的 干 擾 ， 產(chǎn) 生 分 泌 蛋 白 是 一 個 不 錯 的 選 擇 ，3 .為 了 方 便 檢 測 和 純 化 蛋 白 產(chǎn) 物 ， 可 以 表 達 一 個 融 合 標 簽 （HA、 HISx6 、 C-Myc、 Flag、 GST等 ） 。 原 核 表 達 體 系 真 核 表 達 體 系 體 外 轉(zhuǎn) 錄 翻 譯 體 系 表 達 載 體 SDS-PAGE of the

21、lysate of uninduced and induced host bacteria E. coli BL2 1 (DE3 ) containing the control expression vector or the recombinant expression vector and the purified recombinant protein. M protein marker, 1 lysate of E. coli BL2 1 (DE3 ) containing pET-3 0 a(+) without IPTG induction, 2 pET-3 0 a(+) with IPTG induction, 3 pET-3 0 a(+)-CsTRIP-1 without IPTG induction, 4 pET-3 0 a(+)-CsTRIP-1 with IPTG induction, 5 the purified recombinant CsTRIP-1 protein