《重組DNA技術(shù)》PPT課件

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1、第 40章 、 重 組 DNA技 術(shù)1. 目 的 基 因 的 獲 取2. 克 隆 載 體 的 選 擇 與 構(gòu) 建3. 外 源 基 因 與 載 體 的 連 接4. 重 組 DNA導(dǎo) 入 受 體 菌5. 重 組 體 的 篩 選6. 克 隆 基 因 的 表 達(dá) 1. 化 學(xué) 合 成 法2. 基 因 組 DNA3. cDNA4. 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) 基 本 概 念 基 因 （ gene） ： P219 基 因 組 （ genome） ： P292 基 因 組 學(xué) （ genomics） ： 研 究 基 因 組 的 結(jié) 構(gòu) 、 信 息 與 功 能 的科 學(xué) 。 基 因 組 計(jì) 劃 ： HGPP440

2、 后 基 因 組 功 能 基 因 組 基 因 文 庫(kù)基 因 組 DNA文 庫(kù) (genomic DNA library) cDNA文 庫(kù) (cDNA library) 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) （ PCR） Polymerase Chain Reaction 基 本 原 理 ： 變 性 、 退 火 、 延 伸 (二 )克 隆 載 體 的 選 擇 和 構(gòu) 建 質(zhì) 粒 DNA 克 隆 載 體 噬 菌 體 DNA 病 毒 DNA 1. 粘 端 DNA間 的 連 接 (1) 同 一 限 制 性 內(nèi) 切 酶 切 割 位 點(diǎn) 連 接 (2) 不 同 限 制 性 內(nèi) 切 酶 切 割 位 點(diǎn) 連 接 2. 平

3、端 DNA間 的 連 接 3. 同 聚 物 加 尾 連 接 4. 人 工 接 頭 連 接 無(wú) 性 繁 殖 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 : 容 易 接 受 外 源 DNA的 狀 態(tài) . 方 式 : 轉(zhuǎn) 化 、 轉(zhuǎn) 染 、 感 染 l導(dǎo) 入 大 腸 桿 菌1. 氯 化 鈣 轉(zhuǎn) 化 法2. 電 擊 法3. 體 外 包 裝 感 染 法 導(dǎo) 入 哺 乳 動(dòng) 物 細(xì) 胞 1. 顯 微 注 射 法 2. 電 穿 孔 法 3. DNA-磷 酸 鈣 共 沉 淀 4. DEAE-葡 聚 糖 轉(zhuǎn) 染 法 5. 病 毒 感 染 法 6. 脂 質(zhì) 體 介 導(dǎo) 法 7. 細(xì) 胞 融 合 法 8. 原 生 質(zhì) 體 融 合 法 9.

4、 微 細(xì) 胞 介 導(dǎo) 法 直 接 選 擇 法1. 抗 藥 性 選 擇2. 標(biāo) 志 補(bǔ) 救3. 分 子 雜 交 法 間 接 篩 選 法 核 酸 水 平*1. 酶 切 圖 譜*2. 核 酸 探 針*3. PCR*4. 序 列 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 水 平免 疫 學(xué) 的 技 術(shù) ： S D S - PA G E 、Western blot、ELISA、 放 免 、免 疫 沉 淀 、熒 光 抗 體 等 (六 )克 隆 基 因 的 表 達(dá) 原 核 表 達(dá) 體 系 表 達(dá) 載 體 的 標(biāo) 準(zhǔn) ： 1. 含 有 大 腸 桿 菌 適 宜 的 選 擇 標(biāo) 志 2. 具 有 能 調(diào) 控 轉(zhuǎn) 錄 、 產(chǎn) 生 大 量

5、mRNA的 強(qiáng) 啟 動(dòng) 子 3. 含 有 適 當(dāng) 的 翻 譯 控 制 序 列 4. 含 有 合 理 設(shè) 計(jì) 的 多 接 頭 克 隆 位 點(diǎn)l真 核 表 達(dá) 體 系 關(guān) 鍵 步 驟 是 將 重 組 DNA導(dǎo) 入 真 核 細(xì) 胞 DNA克 隆 的 基 本 過(guò) 程1. 分 ： 分 離 目 的 基 因2. 切 ： 對(duì) 目 的 基 因 和 載 體 適 當(dāng) 切 割3. 接 ： 目 的 基 因 與 載 體 連 接4. 轉(zhuǎn) ： 重 組 DNA轉(zhuǎn) 入 受 體 菌5. 篩 ： 篩 選 出 含 有 重 組 體 的 受 菌 體 基 因 工 程 技 術(shù) 策 略分 ： 基 因 載 體 目 的 基 因 質(zhì) 粒 噬 菌 體

6、病 毒 直 接 分 離 cDNA 人 工 合 成 基 因 文 庫(kù)切 ： 限 制 性 內(nèi) 切 酶 有 缺 口 的 載 體 目 的 基 因接 ： 連 接 酶 粘 端 連 接 平 端 連 接 尾 接 法 重 組 體 轉(zhuǎn) ： 轉(zhuǎn) 化 轉(zhuǎn) 染 體 外 包 裝 帶 重 組 體 的 宿 主篩 ： 表 型 篩 選 電 泳 法 核 酸 雜 交 基 因 工 程 技 術(shù) 與 醫(yī) 學(xué) 的 關(guān) 系1.生 命 科 學(xué) 研 究 的 趨 勢(shì)2.疾 病 基 因 的 發(fā) 現(xiàn)3.發(fā) 展 生 物 制 藥4.基 因 診 斷 與 基 因 治 療5.遺 傳 病 的 預(yù) 防 基因工程的目的1. 醫(yī) 學(xué) 用 途 : 超 過(guò) 種 基 因 治 療

7、 法 已 經(jīng)在 全 球 推 行2. 改 善 農(nóng) 業(yè) : 糧 食 產(chǎn) 量 大 增 ， 解 決 飢 荒 ； 抵抗 病 蟲(chóng) 害 ， 耐 寒 耐 旱 ， 防 止 早 熟 和 腐 爛 ，保 存 期 更 長(zhǎng) 。3. 稀 有 動(dòng) 物 的 保 育 : 拯 救 瀕 臨 絕 種 的 動(dòng) 物4. 其 他 :政 治 用 途 、 經(jīng) 濟(jì) 用 途 、 娛 樂(lè) 用 途 等 。 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 ， 目 前 最 常 見(jiàn) 的 是 轉(zhuǎn) 入 抗 除 草 劑 基因 ， 這 樣 的 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 可 以 抵 抗 普 通 的 、 較 溫和 的 除 草 劑 ， 因 此 農(nóng) 民 用 這 類 除 草 劑 就 可 以 除去 野 草 ，

8、而 不 必 采 用 那 些 毒 性 較 強(qiáng) 、 較 有 針對(duì) 性 的 除 草 劑 。 其 次 是 轉(zhuǎn) 入 抗 蟲(chóng) 害 基 因 ， 用 得 最 多 的 是 從 芽 孢桿 菌 克 隆 出 來(lái) 的 一 種 基 因 ， 有 了 這 種 基 因 的 作物 會(huì) 制 造 一 種 毒 性 蛋 白 ， 對(duì) 其 他 生 物 無(wú) 毒 ， 但能 殺 死 某 些 特 定 的 害 蟲(chóng) ， 這 樣 農(nóng) 民 就 可 以 減 少噴 灑 殺 蟲(chóng) 劑 。 據(jù) 統(tǒng) 計(jì) ， 在 過(guò) 去 的 四 年 內(nèi) ， 美 國(guó)由 于 推 廣 抗 蟲(chóng) 害 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 ， 少 噴 灑 了 270萬(wàn)磅 的 殺 蟲(chóng) 劑 。 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 還

9、能 增 加 產(chǎn) 品 ， 例 如抗 蟲(chóng) 害 轉(zhuǎn) 基 因 玉 米 能 增 產(chǎn) 5 15 。 轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) 也 可 用 于 改 變 食 物 的 營(yíng) 養(yǎng) 成 分 ， 例如 減 少 土 豆 的 水 分 ， 這 樣 炸 出 來(lái) 的 土 豆 片 更脆 ； 降 低 植 物 油 中 的 不 飽 和 脂 肪 酸 ， 能 延 長(zhǎng) 儲(chǔ)存 期 限 。 轉(zhuǎn) 基 因 西 紅 柿 不 僅 容 易 運(yùn) 輸 、 保 存 ， 而 且 味 道 也 更 佳 。 菲 律 賓 的 國(guó) 際 水 稻 研 究 院正 在 試 驗(yàn) “ 金 水 稻 ” ， 通 過(guò) 轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) 讓 水 稻制 造 貝 塔 胡 蘿 卜 素 （ 維 生 素 A

10、的 前 體 ） ， 有 助于 消 滅 在 亞 洲 地 區(qū) 廣 泛 存 在 的 維 生 素 A缺 乏 癥 。轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) 也 可 提 高 水 稻 中 鐵 元 素 的 含 量 ，以 減 少 亞 洲 婦 女 常 見(jiàn) 的 貧 血 癥 。 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 的 歷 史 很 短 。 1992年 ， 中 國(guó) 種 植 了世 界 上 第 一 批 商 用 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 轉(zhuǎn) 基 因 煙 草 。1994年 ， 美 國(guó) 市 場(chǎng) 上 才 首 次 出 現(xiàn) 了 轉(zhuǎn) 基 因 食 品 ，一 種 軟 化 緩 慢 的 西 紅 柿 。 由 于 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 的 巨大 優(yōu) 勢(shì) ， 推 廣 非 常 快 。 到 2000

11、年 ， 全 世 界 已 有4420萬(wàn) 公 頃 的 土 地 種 植 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 ， 其 中 美 國(guó)占 68 ， 阿 根 廷 占 23 ， 加 拿 大 占 7 ， 中 國(guó)占 1 ， 其 他 國(guó) 家 占 1 。 大 豆 、 玉 米 、 棉 花 和油 菜 是 主 要 的 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 ， 在 美 國(guó) ， 有 近 一 半的 大 豆 、 棉 花 ， 超 過(guò) 三 分 之 一 的 玉 米 、 油 菜 是轉(zhuǎn) 基 因 作 物 。 美 國(guó) 超 級(jí) 市 場(chǎng) 上 的 食 物 制 品 中 ，約 60 含 有 轉(zhuǎn) 基 因 的 成 分 。 在 公 眾 的 反 對(duì) 聲 中 ，目 前 這 個(gè) 發(fā) 展 勢(shì) 頭 已 緩

12、 慢 下 來(lái) ， 特 別 是 在 工 業(yè)化 國(guó) 家 ， 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 的 種 植 面 積 有 減 少 的 趨 向 。美 國(guó) 雖 然 還 沒(méi) 有 限 制 轉(zhuǎn) 基 因 作 物 ， 但 是 由 于 美國(guó) 是 農(nóng) 產(chǎn) 品 出 口 大 國(guó) ， 歐 洲 、 日 本 對(duì) 轉(zhuǎn) 基 因 作物 進(jìn) 口 的 限 制 ， 也 打 擊 了 美 國(guó) 農(nóng) 民 的 積 極 性 。 Transgenic tobacco plant with gene for firefly luciferase 關(guān) 于 基 因 工 程 的 爭(zhēng) 議A.花 那 麼 多 經(jīng) 費(fèi) 研 究 基 因 工 程 ， 卻 不 能 妥 善 照 顧貧 困 的

13、 病 人 ， 不 關(guān) 心 是 否 建 立 比 較 健 全 的 公 共衛(wèi) 生 體 系 ， 來(lái) 有 效 預(yù) 防 和 治 療 疾 病 ， 或 是 訂 定較 完 整 的 社 會(huì) 福 利 措 施 ， 這 樣 是 否 合 乎 倫 理 ？ B.掌 握 基 因 工 程 科 技 的 強(qiáng) 國(guó) 是 否 藉 著 優(yōu) 勢(shì) 來(lái) 宰 制弱 小 國(guó) 家 ？ 基 因 工 程 技 術(shù) 落 入 犯 罪 集 團(tuán) 或 野 心家 手 中 怎 麼 辦 ？ 提 高 了 糧 食 產(chǎn) 量 ， 是 否 造 成 另一 個(gè) 資 源 分 配 不 均 的 問(wèn) 題 ？ Arguments on Human Cloning A.人 是 否 該 擁 有 基 因

14、 專 利 權(quán) ？ 是 否 可 以 轉(zhuǎn) 讓 出賣(mài) ？ 新 的 基 因 組 合 的 專 利 是 屬 於 科 學(xué) 家 (醫(yī) 生 )的 ， 還 是 那 個(gè) 複 製 人 的 ？ 如 何 保 護(hù) 專 利 權(quán) ？如 果 有 人 在 街 上 砍 你 一 刀 ， 取 得 血 液 細(xì) 胞 來(lái)複 製 人 ， 那 怎 麼 辦 ？ 在 醫(yī) 院 裡 ， 外 科 醫(yī) 生 偷偷 用 你 的 細(xì) 胞 複 製 人 怎 麼 辦 ？ Arguments on Human Cloning Ethical Considerations .複 製 人 的 養(yǎng) 育 責(zé) 任 是 誰(shuí) ？ 複 製 人 長(zhǎng) 大 以 後 是 否告 知 其 出 身 ？

15、 .誰(shuí) 是 他 的 父 母 ？ 被 複 製 人 與 被 複 製 人 的 配 偶 ？被 複 製 人 的 父 母 ？ 科 學(xué) 家 (醫(yī) 生 )？ 代 理 孕 母 ？ .複 製 人 推 翻 家 庭 婚 姻 制 度 ， 使 得 生 育 不 再 是 家庭 婚 姻 內(nèi) 的 產(chǎn) 物 ， 他 可 能 沒(méi) 有 自 己 的 家 庭 。 .社 會(huì) 應(yīng) 該 如 何 看 待 複 製 人 ？ 如 何 免 受 歧 視 ？ 人權(quán) 、 社 會(huì) 地 位 、 法 律 身 分 如 何 定 義 ？ 生 命 價(jià) 值 問(wèn) 題 .一 個(gè) 人 有 權(quán) 決 定 另 一 個(gè) 人 的 基 因 嗎 ？ 有 權(quán) 決 定 另 一 個(gè) 人 的 生 命嗎 ？

16、 .複 製 人 因 為 科 學(xué) 家 (醫(yī) 生 )的 疏 忽 造 成 的 生 理 缺 陷 ， 導(dǎo) 致 心 理 不平 衡 的 問(wèn) 題 。 .社 會(huì) 一 定 偏 好 複 製 傑 出 或 特 殊 人 士 (如 愛(ài) 因 斯 坦 或 希 特 勒 )， 所以 複 製 人 處 處 被 別 人 拿 來(lái) 和 被 複 製 者 比 較 ， 可 能 他 沒(méi) 有 被 複 製 者有 極 高 的 成 就 而 感 到 挫 折 。 複 製 人 沒(méi) 有 自 由 選 擇 自 己 前 途 ， 活 在被 複 製 者 的 陰 影 ， 被 物 化 ， 市 場(chǎng) 化 。 他 選 擇 人 生 的 方 向 、 興 趣 、生 活 被 剝 奪 ， 因

17、為 社 會(huì) 要 求 麥 克 喬 丹 的 複 製 人 打 籃 球 ， 可 是 他 喜 歡 踢 足 球 。 他 會(huì) 羨 慕 別 人 沒(méi) 有 這 些 問(wèn) 題 ， 並 且 怨 恨 自 己 的 命 運(yùn) 、怨 恨 科 學(xué) 家 ( 醫(yī) 生 )、 怨 恨 被 複 製 者 . .製 造 出 一 堆 體 育 高 手 ， 那 麼 運(yùn) 動(dòng) 會(huì) 有 何 意 義 ？ 製 造 出 一 堆 品 種優(yōu) 良 的 人 類 ， 那 麼 由 自 然 生 育 的 ， 而 且 品 種 較 差 的 人 、 殘 障 的 人 ，他 們 的 生 命 有 何 意 義 ？ 複 製 人 顛 覆 了 社 會(huì) 對(duì) 人 的 價(jià) 值 的 觀 念 ， 對(duì)人 成

18、功 有 新 的 解 釋 :那 是 因 為 他 品 種 好 啊 ！ 醫(yī)療倫理、道德責(zé)任與科學(xué)研究問(wèn)題 .複 製 自 己 來(lái) 取 得 器 官 合 乎 道 德 嗎 ？ 這 是 不 道 德 的 ， 現(xiàn)行 法 律 會(huì) 以 傷 害 罪 來(lái) 起 訴 。 因 為 複 製 人 不 是 他 的 備 份 ，任 他 宰 割 的 。 退 一 步 來(lái) 問(wèn) ， 用 基 因 工 程 故 意 造 出 腦 死 的 、無(wú) 頭 的 、 早 死 的 複 製 人 來(lái) 移 植 器 官 合 乎 道 德 嗎 ？ .用 基 因 重 組 產(chǎn) 生 一 種 類 似 人 類 的 動(dòng) 物 來(lái) 移 植 器 官 ， 或是 把 動(dòng) 物 注 射 人 類 基 因

19、， 那 麼 這 個(gè) 動(dòng) 物 要 含 有 多少 人 類 基 因 才 能 擁 有 人 權(quán) 呢 ？ 90%的 人 類 基 因 嗎 ？ 80%呢 ？ 50%呢 ？ .造 出 四 肢 發(fā) 達(dá) 、 頭 腦 簡(jiǎn) 單 的 人 ， 來(lái) 供 人 使 役 的 不 道 德作 法 。 .診 斷 錯(cuò) 誤 的 責(zé) 任 承 擔(dān) 、 複 製 人 有 缺 陷 的 責(zé) 任 問(wèn) 題 。 .代 理 孕 母 的 道 德 問(wèn) 題 。 她 是 否 淪 為 孵 卵 機(jī) 器 ， 把子 宮 出 租 十 個(gè) 月 ？ 問(wèn) ： 試 管 嬰 兒 剛 出 來(lái) 的 時(shí) 候 不 為 世 人 所 容 ， 但 后 來(lái)也 漸 漸 被 接 受 了 ， 克 隆 人 在

20、將 來(lái) 會(huì) 不 會(huì) 也 被 人 們 接受 呢 ？ 蘭 德 ： 試 管 嬰 兒 和 克 隆 人 有 本 質(zhì) 區(qū) 別 ， 試 管 嬰 兒 說(shuō)到 底 還 是 精 子 和 卵 子 的 結(jié) 合 ， 是 一 種 自 然 的 生 育 方式 。 我 看 不 出 克 隆 人 有 何 必 要 和 好 處 。 我 很 高 興 地看 到 ， 美 國(guó) 已 經(jīng) 出 臺(tái) 了 禁 止 克 隆 人 的 法 律 。 我還 想 說(shuō) 說(shuō) 細(xì) 胞 治 療 和 干 細(xì) 胞 研 究 。 我 絕 對(duì) 支 持 這 種技 術(shù) ， 它 不 是 克 隆 人 ， 而 是 克 隆 細(xì) 胞 ， 比 如 克 隆 出一 個(gè) 可 以 發(fā) 育 成 胰 腺 的 細(xì)

21、 胞 來(lái) 治 療 糖 尿 病 。 有 人 用克 隆 性 治 療 來(lái) 描 述 細(xì) 胞 治 療 ， 我 認(rèn) 為 克 隆 性 治 療 這個(gè) 詞 非 常 不 好 ， 容 易 和 克 隆 人 產(chǎn) 生 混 淆 。 不 幸 的 是 ，包 括 美 國(guó) 國(guó) 會(huì) 一 些 議 員 在 內(nèi) 的 很 多 人 就 鬧 不 清 楚 細(xì)胞 治 療 和 克 隆 人 的 區(qū) 別 。 年 月 日 英 國(guó) 自 然 雜 志 關(guān) 于 人 類基 因 組 草 圖 論 文 的 第 一 作 者 問(wèn) ： 世 界 上 所 有 生 物 的 基 因 一 旦 全 部 被 破 解 ，會(huì) 不 會(huì) 一 切 都 像 玩 拼 圖 一 樣 ？ 柯 林 斯 ： 這 是

22、 一 個(gè) 很 嚴(yán) 肅 的 問(wèn) 題 ， 但 它 的 答 案也 非 常 簡(jiǎn) 單 ， 那 就 是 “ 不 ” 。 我 們 現(xiàn) 在 就 像一 個(gè) 無(wú) 知 的 孩 子 ， 剛 剛 走 進(jìn) 一 個(gè) 碩 大 的 圖 書(shū) 館 ，圖 書(shū) 館 中 擺 著 許 許 多 多 生 命 的 天 書(shū) ， 它 們 是自 然 花 了 幾 十 億 年 時(shí) 間 寫(xiě) 就 的 。 我 們 現(xiàn) 在 知道 的 不 過(guò) 是 其 中 一 點(diǎn) 點(diǎn) ， 千 萬(wàn) 不 要 自 以 為 是 。我 們 閱 讀 這 些 生 命 天 書(shū) 的 時(shí) 候 ， 應(yīng) 當(dāng) 對(duì) 上 帝的 創(chuàng) 造 深 深 地 感 恩 ， 而 不 是 去 扮 演 上 帝 的 角 色 。 美 國(guó) 國(guó) 家 人 類 基 因 組 研 究 所 所 長(zhǎng) 、 美 國(guó) 科 學(xué) 院院 士 本 章 內(nèi) 容 小 結(jié) 概 念 ： 接 合 、 轉(zhuǎn) 化 、 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 、 轉(zhuǎn) 染 、 轉(zhuǎn) 座 重 組 DNA技 術(shù) 、 載 體 、 質(zhì) 粒 、 基 因 組 DNA、cDNA等 自 然 界 基 因 重 組 的 幾 種 方 式 重 組 DNA技 術(shù) 的 基 本 原 理 ， 用 五 個(gè) 字 概 括 目 的 基 因 獲 取 的 幾 種 方 式 外 源 基 因 與 載 體 連 接 的 幾 種 方 式