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1、
DNA的粗提取與鑒定
[導(dǎo)學(xué)誘思 ]
1.提取 DNA 的方法
提取生物大分子的基本思路是 。
對(duì)于 DNA 的粗提取而言, 就是要利用 、 等在物理和化學(xué)性質(zhì)方
面的差異,提取 DNA,去除其他成分。
1) DNA 的溶解性 DNA 和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的 中溶解度不同,
利用這一特點(diǎn),選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使 充分溶解,而使雜質(zhì)沉淀,或者相反,
以達(dá)到分離目的。
圖 5— 1 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲線,請(qǐng)根據(jù)曲線圖,思考:
①在什么濃度下, DNA 的溶解度最小? DNA 在 N
2、aCl 溶液中的溶解度是如何變化的?
②如何通過控制
NaCl 溶液的濃度使 DNA 在鹽溶液中溶解或析出?
此外, DNA 不溶于
溶液,但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原
理,可以將 DNA 與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。
2) DNA 對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性
蛋白酶能水解
,但是對(duì)
沒
有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受
60— 80oC 的高溫,而 DNA 在
以上才會(huì)變性。洗滌
劑能夠瓦解
,但對(duì) DNA 沒有影響。
3) DNA 的鑒定
在
條件下, DNA 遇
會(huì)被染成
色,
3、因此二苯胺可以作為鑒定
DNA 的試劑。
2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1 ) 實(shí) 驗(yàn) 材 料 的 選 取
凡 是 含 有
的 生 物 材 料 都 可 以 考 慮 , 但 是 使 用
的生物組織,成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的實(shí)驗(yàn)材料:
魚卵、豬肝、菜花(花椰菜) 、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌
思考:
哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞的特點(diǎn)?
2)破碎細(xì)胞,獲取含 DNA 的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易 ,以雞血細(xì)胞為例,在雞
血細(xì)胞液中加入一定量的 ,同時(shí)用 攪拌,過
4、濾后收集濾液即可。 如果實(shí)驗(yàn)材料
是植物細(xì)胞,需要先用 溶解細(xì)胞膜。例如,提取洋蔥的 DNA 時(shí),在切碎的洋蔥中
加入一定的 和 ,進(jìn)行充分的攪拌和研磨,過濾后收集研磨液。
思考:
①為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂?
②加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么?
③如果研磨不充分,會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響 ?
用心 愛心 專心
④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分?
3)去除濾液中的雜質(zhì) 閱讀課本的三個(gè)方案,
思考:
為什么反復(fù)地溶解與析
5、出 DNA,能夠去除雜質(zhì)?
方案二與方案三的原理有什么不同?
4) DNA 的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾 ,加入與濾液體積 、冷卻
的 ,靜置 ,溶液中會(huì)出現(xiàn) ,這就是粗提取的 DNA。用玻璃棒
攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸取上面的水分。
取兩支 20ml 的試管,各加入物質(zhì)的量濃度為 的 NaCl 溶液 5ml ,將絲狀物放
入其中一支試管中,用玻璃棒攪拌,使絲狀物溶解。然后,向兩支試管中各加入 4ml 的
?;旌暇鶆蚝?,將試管置于 中加熱 5min ,待試管冷卻后,比較兩支
試管溶液顏色的變化,看看溶解有
6、DNA 的溶液是否變 。
3.操作提示
以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),每 100ml 血液中需要加入 3g ,防止 。
加入洗滌劑后, 動(dòng)作要 、 ,否則容易產(chǎn)生大量的泡沫, 不利于后續(xù)步
驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí),動(dòng)作要 ,以免 ,導(dǎo)致 DNA
分子不能形成絮狀沉淀。
二苯胺試劑要 ,否則會(huì)影響鑒定的效果。
4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
[疑難點(diǎn)撥 ]
1. DNA 的溶解度與 NaCl 溶液濃度的關(guān)系:
當(dāng) NaCl 溶液濃度低于
0.14mol/L 時(shí),隨濃度的升高, DNA 的溶解度降低;當(dāng) NaCl
7、溶液
濃度高于 0.14mol/L 時(shí),隨濃度升高, DNA 的溶解度升高。
2. 制備雞血細(xì)胞液時(shí),要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉的原因
制備雞血細(xì)胞液時(shí), 要在新鮮的雞血中加入抗凝劑——檸檬酸鈉,
防止血液凝固。 其
原理是檸檬酸鈉能與血漿中
Ca2+發(fā)生反應(yīng), 生成檸檬酸鈣絡(luò)合物, 血漿中游離的 Ca2+大大減
少,血液便不會(huì)凝固,因?yàn)殡u血紅細(xì)胞,白細(xì)胞都有細(xì)胞核,
DNA 主要存在于細(xì)胞核中,
所以在離心或靜置沉淀后,要棄出上層清液——血漿。
3.提取 DNA 的第一步是材料的選取,其目的是一定要選取
DNA 含量較高的生物材
8、料,否
則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難;第二步是
DNA 的釋放和溶解,這
一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵,要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的
DNA 全部溶解;第三步是 DNA 的純化,
即根據(jù) DNA 的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性,最大限度地將
DNA 與雜質(zhì)分
開;最后一步是對(duì) DNA 進(jìn)行鑒定,這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。
4.在 DNA 的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時(shí),注意動(dòng)作要輕緩,以免加劇
DNA 分子的斷
裂,導(dǎo)致 DNA 分子不能形成絮狀沉淀。
5.盛放雞血細(xì)胞液的容器,最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的
9、DNA,容易被玻
璃容器吸附,由于細(xì)胞內(nèi)
DNA 的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到
的 DNA 就會(huì)更少。因此,實(shí)驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管,這樣可以減少提取過程
用心 愛心 專心
的 DNA 的損失。
[典例解析 ]
本實(shí)驗(yàn)中有三次過濾:
⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液
⑵過濾含粘稠物的 0.14mol/LNaCl 溶液
⑶過濾溶解有 DNA 的 2mol/LNaCl 溶液
以上三次過濾分別為了獲得(
)
A 含核物質(zhì)的濾
10、液、紗布上的粘稠物、含
DNA 的濾液
B 含核物質(zhì)的濾液、濾液中
DNA 粘稠物、含
DNA 的濾液
C 含核物質(zhì)的濾液、濾液中
DNA 粘稠物、紗布上的 DNA
D 含較純的 DNA 濾液、紗布上的粘稠物、含
DNA 的濾液
答案: A
解析 :用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液,使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂,釋放出核物質(zhì),此時(shí)過濾只能得到含 DNA 和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液,這種濾液必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)中其他步驟得相繼處
理,方能得到較純的 DNA。DNA 在 0.13mol/LNaCl 溶液中溶解度最低,成絲狀粘稠物,可經(jīng)過濾留在紗布上。
【課本問題
11、答案和提示】
(一)旁欄思考題
1.為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂?
答:蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體, 水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi), 使血細(xì)胞脹裂,再加上攪拌的機(jī)械作用, 就加速了雞血細(xì)胞的破裂 (細(xì)胞膜和核膜的破裂 ),從而釋放出 DNA。2.加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么?
答:洗滌劑是一些離子去污劑, 能溶解細(xì)胞膜, 有利于 DNA 的釋放;食鹽的主要成分是 NaCl,
有利于 DNA 的溶解。
3.如果研磨不充分,會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?
答:研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的 DNA 釋放不完全,提取的 DNA 量變少,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
12、,導(dǎo)
致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。
4.此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分?
答:可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等雜質(zhì)。
5.為什么反復(fù)地溶解與析出 DNA,能夠去除雜質(zhì)?
答:用高鹽濃度的溶液溶解 DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使 DNA 析
出,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。 因此,通過反復(fù)溶解與析出 DNA,就能夠除去與 DNA 溶解度不同的多種雜質(zhì)。
6.方案二與方案三的原理有什么不同?
答:方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白,從而使提取的 DNA 與蛋白質(zhì)分開;方案三利用的
是 D
13、NA 和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同,從而使蛋白質(zhì)變性,與 DNA 分離。
(二)練習(xí)
1.答:提取 DNA 的第一步是材料的選取,其目的是一定要選取 DNA 含量較高的生物材料,
否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難;第二步是 DNA 的釋放和溶解,
這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵, 要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的 DNA 全部溶解; 第三步是 DNA 的純化,
用心 愛心 專心
即根據(jù) DNA 的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性,最大限度地將 DNA 與雜質(zhì)分
開;最后一步是對(duì) DNA 進(jìn)行鑒定,
14、這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。
2.答:提取蛋白質(zhì)比提取 DNA 的難度大。這是因?yàn)?,與 DNA 相比,蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃
度、 pH 等條件要敏感得多,很容易失活;并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣,理化性質(zhì)各不
相同,使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法, 只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件,
設(shè)計(jì)特定的方法。
【知識(shí)拓展 】
1.二苯胺鑒定 DNA 的化學(xué)原理
DNA 中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成 ω-羥基 -γ 酮基戊醛, 它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍(lán)
色(溶液呈淺藍(lán)色 )。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺,與溶液中 DNA 含量的多少有關(guān)。
2.研
15、磨液中幾種藥品的作用
Tris/HCl:提供緩沖體系, DNA 在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)( Tris 為三羥甲基氨基甲烷) 。
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉) :是 DNA 酶的抑制劑,可以防止細(xì)胞破碎后 DNA 酶降解 DNA。
SDS(十二烷基磺酸鈉) :可以使蛋白質(zhì)變性,與 DNA 分離。
【教學(xué)反思】
用心 愛心 專心