2019-2020年高中生物 5.2《多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷》教學設計 新人教版選修1.doc
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2019-2020年高中生物 5.2《多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷》教學設計 新人教版選修1 教材內容解讀 要點1 多聚酶鏈式反應 多聚酶鏈式反應是一種體外迅速擴增DNA片段的技術,它能以極少量的DNA為模 板,在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。 要點2 PCR原理 (1)在用PCR技術擴增DNA時,DNA的復制過程與細胞內DNA的復制類似.細胞內參與DNA復制的各種成分和基本條件以及各自的作用如下表: 參與的組分 在DNA復制中的作用 解旋酶 打開DNA雙鏈 DNA母鏈 提供DNA復制的模板 4種脫氧核苷酸 合成子鏈的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸 (2)DNA的方向 通常將DNA的羥基(-OH)末端稱為3’端,面磷酸基團的末端稱為5’端。 (3)引物 引物是一小段DNA或RNA,它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。 引物的作用:DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從引物的3端延伸DNA鏈,因此,DNA復制需要引物。 (4)DNA的合成方向 當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后,DNA聚合酶就能從引物的3’端開始延伸DNA鏈,DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸。 (5)DNA的變性與復性 在80-100℃的溫度范圍內,DNA的雙螺旋結構將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性。當溫度緩慢降低后,兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈,這個過程稱為復性。 (6)PCR對DNA雙鏈的解聚與結合控制 PCR利用了DNA的熱變性原理,通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合。 (7)TaqDNA聚合酶的應用 PCR中的高溫會導致普通DNA聚合酶失活,而耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了這個問題,大大增加了PCR的效率,使PCR技術趨向自動化。 (8)PCR擴增DNA的基本條件 PCR反應需要在一定的緩沖溶液中提供:DNA模板,分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物。四種脫氧核苷酸,耐熱的DNA聚合酶,同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。 要點3 PCR的反應過程 PCR一般要經歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為變性、復性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始,上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合,進行DNA的延伸。這樣,DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。 要點4 實驗操作 做PCR通常使用微量離心管,它是一種薄壁塑料管,總容積為0.5mL。具體操作時,用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分,再設計好PCR儀的循環(huán)程序就可以了。 如果沒有PCR儀,可以設置3個恒溫水浴鍋,溫度分別為94℃、55℃和72℃,然后按照上表的要求,在3個水浴鍋中來回轉移PCR反應的微量離心管即可。 PCR的突出優(yōu)點是快速、高效、靈活和易于操作。 要點5 DNA含量的測定 DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰(見下圖)??梢岳肈NA的這一特點進行DNA含量的測定。具體步驟如下: (1)將樣品進行50倍稀釋:取2LPCR反應液,加入98L蒸餾水。 (2)以蒸餾水作為空白對照,在波長260nm處,將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零。 (3)加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中,測定260nm處的光吸收值。 (4)計算DNA含量。公式:DNA含量(g)=50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)。 要點6 實驗注意事項 (1)為避免外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及 蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸氣滅菌。 (2)在微量離心管中添加反應成分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后,蓋嚴離心管口的蓋子,用手指輕輕彈擊管的側壁,使反應液混合均勻,再將微量離心臂放在離心機上,離心約10s,使反應液集中在離心管底部,再放入PCR儀中 進行反應。- 配套講稿:
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