《生物芯片分析》PPT課件.ppt
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生物芯片(Biochip),武漢大學生物醫(yī)學工程系趙旻,本章提綱,生物芯片簡介與沿革生物芯片的分類基因芯片基本原理、流程與應用蛋白質芯片及應用其它芯片技術,第一節(jié)生物芯片簡介與沿革,什么是生物芯片?生物芯片(Biochip)主要指通過平面微細加工技術,在固體芯片表面等載體上的微型生物化學分析系統(tǒng),以實現(xiàn)對細胞、蛋白質、核酸以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。,,芯片上每平方厘米可密集排列成千上萬個生物分子(Microarray),能快速準確地檢測細胞、蛋白質、DNA及其他生物組分,并獲取樣品中的有關信息,其效率是傳統(tǒng)檢測方法的成百上千倍。,生物芯片分析基本流程,,建立,1996年美國Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實驗室試驗用的生物芯片,并制作出相應的芯片系統(tǒng)。此外,美國的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在積極開展DNA芯片研究工作。近二年,摩托羅拉、惠普、IBM等跨國公司也相繼投以巨資加入生物芯片的研究開發(fā)。,,中國在生物芯片領域起步較晚,我國是從一九九七年才開始對生物芯片研究,而國外從八十年代起就開始研制生物芯片。中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物芯片分會——國際生物芯片領域的第一個行業(yè)性組織2006在北京成立。中國在北京、上海、陜西、天津、南京建立了五大生物芯片研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化基地。我國生物芯片產(chǎn)業(yè)尚未形成統(tǒng)一的技術標準,不規(guī)范。在產(chǎn)品認證認可方面也存在與國際慣例不接軌的情況。,第二節(jié)生物芯片的分類,一般分類,,,根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類:信息生物芯片和功能生物芯片,第三節(jié)基因芯片——基本原理、流程與應用,本節(jié)內容提要,1.簡介2.圖像處理與數(shù)據(jù)標準化3.基因芯片的數(shù)據(jù)分析4.芯片工具&數(shù)據(jù)庫,簡介,基因芯片(Genechip)技術是指通過微陣列(Microarray)技術將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面,以熒光標記的DNA探針,借助堿基互補雜交原理,進行大量的基因表達及檢測等研究的技術。,基因芯片發(fā)展歷史,,Southern&NorthernBlot,,,DotBlot,Macroarray,Microarray,,,,,,基因芯片,1.根據(jù)免疫測定的(immunoassay)的方法予以改進2.高通量、點陣以及Northern雜交3.同時測定細胞內數(shù)千個基因的表達情況4.芯片的體積非常?。何⒘繕悠返臋z測5.基因表達情況的定量分析,基因芯片的原理,依據(jù)雙螺旋原理,核酸分子雜交技術,在靶標樣品與探針之間進行選擇性反應,將反應一方(探針)固定在芯片上,另一方(熒光標記,即制備好的cDNA,分別標記綠色的Cy3和紅色的Cy5)通過流路或加至芯片上。,核酸雜交,RNA,DNA1,DNA2,Probe,Southernhybridization,Northernhybridization,,,,,,,JuangRH(2004)BCbasics,基因芯片的密度:100-1millionDNA探針/1cm2,將樣品中的DNA/RNA表上熒光標記,則可以定量檢驗基因的表達水平,堿基互補,基因芯片流程,樣品制備,芯片制備,,,雜交,雜交信號檢測,數(shù)據(jù)分析,,,,,實驗流程,,,,,基因表達情況的定量測定,1.發(fā)現(xiàn)在特定生長時期,或者隨著環(huán)境變化,那些基因的表達收到誘導或者抑制2.在相同條件下,上調或者下調變化規(guī)律相似的基因,可能具有功能上的關聯(lián)3.可以從共表達的基因中尋找調控模體4.基因表達的模式可以用來表征異常的細胞調控,例如,癌癥的診斷,基因芯片分類,按芯片制備方法分類原位合成芯片(syntheticgenechip)DNA微陣列芯片(DNAmicroarray)按探針分類寡核苷酸陣列(芯片)DNA陣列基因芯片cDNA芯片RNA芯片,,ComparisonofDNAChipTechnologies,SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise),Oligo-ChipcDNA-ChipGenomicChip8nor20n50,000n,sequencing,expression,expression,genomicanalysis,,基因芯片技術的類型,按技術手段、探針類型分類1.Shortoligonucleotidearrays(Affymetrix)2.cDNAarrays(Brown/Botstein)3.Longoligoarrays(Agilent)4.Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)按實驗要求分類1.單通道(SingleChannel):一次檢驗一種狀態(tài)2.雙通道(DualChannel):差異表達基因的篩選,,1片上原位合成寡核苷酸點陣芯片(ONA)2微量點樣技術制作的CDNA點陣芯片(CDA)ONA特點:(1)易尋址,利用組合化學的原理安排各寡核苷酸的位點,芯片反應后易尋址;(2)點位牢固,用表面化學方法處理基片(玻璃、硅片、尼龍片),使核苷酸固定在基片上;(3)定點合成,光導向平板印刷技術,芯片表面可用屏蔽物屏蔽,光照選擇性脫保護,有利于定點合成寡核苷酸中的各個堿基;目前技術:1.6cm2;40萬個點;20個核苷酸;,兩類主流的DNA芯片,1.cDNAmicroarrays:將500~5,000bp的cDNA固載到介質上(例如玻璃),Stanford開發(fā)設計,通常為雙通道2.DNAchips:將寡核苷酸探針(20~80-mer)合成到芯片上,Affymetrix開發(fā)設計,通常為單通道,(1)cDNAmicroarrays,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,cDNAclones,,,Robotspotter,普通的蓋玻片,cDNAmicroarrays的制備,差異表達基因的篩選,Treatment/controlNormal/tumortissueBrain/liver…,,點樣后的cDNAMicroarrays,,Genes,mRNAsamples,GeneexpressionlevelofgeneiinmRNAsamplej,,=,Log(Redintensity/Greenintensity),Log(Avg.PM-Avg.MM),sample1sample2sample3sample4sample5…10.460.300.801.510.90...2-0.100.490.240.060.46...30.150.740.040.100.20...4-0.45-1.03-0.79-0.56-0.32...5-0.061.061.351.09-1.09...,,,,,,基因表達的數(shù)據(jù),,(1)DNAchips,DNAchips的制備:Affymetrixphotolitography,探針長度:25bp每個基因:22-40個探針PerfectMatch(PM)vs.MisMatch(MM)probes,點樣后的Genechip,總結,,,,,,基因芯片的實驗流程,2.圖像處理與數(shù)據(jù)標準化,單通道基因芯片white(veryhigh)red(high)Yellow(alittlehigh)green(medium)blue(low)black(no),,圖像處理,植根區(qū)域生長法(SRG),FixedCircle,柵格化:確定點的位置圖象分割(Segmentation):將點從背景中分離出來。抽提亮度:各個像素亮度的平均值(mean)或中位數(shù)(median)背景校正:局部或全局,基因表達量的定量,對于每個點,我們可以計算Redintensity=Rfg-Rbgfg=foreground,bg=background,andGreenintensity=Gfg-Gbgandcombinetheminthelog(base2)ratioLog2(Redintensity/Greenintensity)Greenintensity(medium):~1,,Microarray:誤差的來源,系統(tǒng)的隨機的,,,logsignalintensity,logRNAabundance,,Microarray:誤差的來源,1.圖像分析2.掃描3.DNA雜交過程,溫度、時間、混合均勻程度等4.探針的標記5.RNA的抽提6.加樣7.其他,,,Red/green比值存在亮度的傾向,,,,,,,M=log2R/G=log2R-log2G,=(log2R+log2G)/2,Valuesshouldscatteraboutzero.,,數(shù)據(jù)標準化,before,after,3.基因芯片的數(shù)據(jù)分析,(1)差異表達基因的分析(2)基因共表達分析(3)基因表達數(shù)據(jù)的聚類(4)基因表達數(shù)據(jù)的分類(5)MaptoGO(6)Generegulatorynetwork,(1)差異表達基因的分析,1.差異表達基因的分析:尋找處理前后表達上調或者下調的基因2.Arethetreatmentsdifferent?3.使用標準的統(tǒng)計學方法檢驗(t-testorf-test),發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計顯著性差異表達的基因,4.如果處理本身并不顯著,則結果無意義,統(tǒng)計學分析,1.Foldchange,一般2-foldincreaseordecrease(平行實驗的樣本較少)2.p-value(平行實驗的樣本較多),P-value:學生分布,1.T-test:學生分布2.Excel函數(shù):TTEST(array1,array2,tails,type)Array1為第一個數(shù)據(jù)集Array2為第二個數(shù)據(jù)集Tails指示分布曲線的尾數(shù)。如果tails=1,函數(shù)TTEST使用單尾分布。如果tails=2,函數(shù)TTEST使用雙尾分布Type為t檢驗的類型1成對2等方差雙樣本檢驗3異方差雙樣本檢驗,P-value:學生分布,1.一般選擇雙尾分布2.異方差雙樣本檢驗3.Excel函數(shù):=TTEST(B2:D2,E2:G2,2,3)4.C:對照組;T:實驗組,MultipleComparisons,1.在基因芯片的實驗中,每一個基因/探針,都是一個獨立的實驗2.基因芯片:高通量,>1,000個基因/探針3.因此,無論怎么比較,總會有一些基因會是統(tǒng)計顯著性差異表的——可能是隨機產(chǎn)生的4.如何評估表達差異基因預測的有效性?5.例:1,000個探針的雙通道芯片,以p-value<0.01為域值,發(fā)現(xiàn)7個上調基因,5個下調基因,分析結果是否具有統(tǒng)計學意義?,FalseDiscoveryRate(FDR),1.Falsepositiveprediction:“Type1error"or"FalseDiscovery"2.FalseDiscoveyRate(FDR)=p-value*No.ofGenes上例:FDR=0.01*1,000=10(隨機)7個上調基因,5個下調基因<10因此上例計算的結果無統(tǒng)計學意義3.FDR必須遠小于發(fā)現(xiàn)的差異表達基因數(shù)目實驗的有效性p-value的選擇,(2)基因共表達分析,1.在N個不同的條件下(時間序列的芯片數(shù)據(jù)),考察基因X和Y的表達是否相似2.Gene1#是否與Gene2#、Gene3#和Gene4#共表達?3.共表達:正相關:相似的表達譜,可能存在正關聯(lián)負相關:相反的表達譜,可能存在負調控,EisenMB,etal.,(1998)PNAS95:14863-14868,沒有相關性?,基因相關性分析,1.Spearmanrankcorrelation2.Kendallstau3.Euclideandistance4.Pearsoncorrelationcoefficient:-1~1Excel函數(shù):=PEARSON(array1,array2),EisenMB,etal.,(1998)PNAS95:14863-14868,Pearson相關系數(shù),1.r~[-1,1]r~1,正相關r~-1,負相關,結論:Gene1#與Gene2#表達正相關,與Gene3#表達負相關,與Gene4#無關聯(lián),(3)基因表達數(shù)據(jù)的聚類,1.將表達譜相似的基因聚類在一起2.無督導學習(unsupervisedlearning)3.Patternfinding:發(fā)現(xiàn)新的模式4.聚類方法:A.HierarchicalclusteringB.K-meansclustering,HierarchicalClustering,Hierarchicalclustering,1.用樹狀結構來表征基因表達之間的相似性/相關性2.優(yōu)點:不需要指定結果有多少類,,Distancematrix,,K-meansclustering,1.對數(shù)據(jù)進行聚類2.必須給定結果分成多少類!3.假設,該例中,指定為聚成5類,K-meansclustering,1.隨便選取5個點,作為每一個類的中心點,K-meansclustering,2.計算其他點與這5個中心點的距離距離:歐氏距離馬氏距離皮爾孫相關系數(shù)…點的歸類:離哪個中心點近,歸哪個類,K-meansclustering,3.針對每一類中的每一個點,計算其與其他點的距離,加和,除以該類點的數(shù)目;找到新的中心點,即改點到該類中其他點的平均值最??;確定新的5個中心點!,K-meansclustering,4.重復2,3,直到結果收斂實際操作時,因結果完全收斂時間過長,一般指定迭代的次數(shù),如1,000次,K-meansclustering,5.最終結果:所有基因芯片數(shù)據(jù)被聚成5類軟件:Cluster3.0,MichaelEissen,Stanford,(4)基因表達數(shù)據(jù)的分類,1.根據(jù)基因表達的數(shù)據(jù)將樣本分成兩類或多類;2.督導學習(supervisedlearning):根據(jù)發(fā)現(xiàn)的pattern進行預測3.應用:癌癥vs.正常組織癌癥的亞型、不同階段(良性的vs.惡性的)對藥物的敏感性(tamoxifenforbreastcancer),DiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL),1.通過聚類發(fā)現(xiàn)各種亞型之間的關系2.根據(jù)基因表達模式,能夠預測新的基因表達樣本,(5)MaptoGO,1.通過基因芯片,找到了一批“interesting”的基因2.生物學功能上是否存在關聯(lián)?某種功能是否顯著?3.GeneOntology+超幾何分布,GOToolBox,(6)Generegulatorynetwork,1.早期觀點:表達譜相似的基因可能存在功能上的關聯(lián),可能相互作用…(直接作用)2.當前的觀點:表達譜相似的基因可能具有共同的調控元件(基因UTR區(qū)域存在共同的Promotor),能夠被同一個上游因子所調控,相關系數(shù):基因共表達網(wǎng)絡,ERL2,SKP1,Unknown,ChS1,Wild-type,Mutant,1.與光合效率和氣孔發(fā)育相關的基因:ERL2A.在Wild-type中與之顯著相關,但在Mutant中顯著不相關的基因,相關系數(shù):基因共表達網(wǎng)絡,4.Microarray:工具&數(shù)據(jù)庫,GEO-NCBI,ArrayExpress-EMBL,SMD-Stanford,芯片技術的應用,1基因表達分析:分析基因表達時空特征檢測基因差異表達發(fā)現(xiàn)新基因大規(guī)模測序,,DNA序列測定:雜交測序:sequencingbyhybridization,SBH建立在特定序列的DNA與特定長度的寡核苷酸集合的雜交的基礎之上。未知DNA序列可以通過鑒定與靶DNA序列形成完整的雙鏈體寡核苷酸的重疊區(qū)域來確定;65536個八核苷酸點陣可測定約200個核苷酸的序列;一百萬個十二核苷酸點陣可測定約1000個堿基對。,,2基因型、基因突變和多態(tài)性分析分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關系3疾病的診斷與治療遺傳病相關基因的定位:產(chǎn)前篩查與診斷腫瘤診斷感染性疾病的診斷基因突變檢測與遺傳病和腫瘤診斷大量平行測定。,,4.藥物研究中的應用新藥開發(fā)發(fā)現(xiàn)藥物的新功能調查藥物處理細胞后基因的表達情況對藥物進行毒性評價在基因水平上尋找藥物靶標,毒性對基因的影響。,,其它:病原體的檢出腫瘤相關基因表達譜位點突變耐藥基因檢測疾病的分子分型HLA分型,,細胞凋亡PCR芯片細胞周期PCR芯片血管生成PCR芯片腫瘤轉移PCR芯片癌通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片DNA損傷信號通路PCR芯片氧化應激與抗氧化PCR芯片應激和毒性通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片腫瘤藥物耐受和代謝PCR芯片細胞因子PCR芯片,乳腺癌和雌激素受體信號通路PCR芯片藥物代謝PCR芯片內皮細胞生物學功能研PCR芯片骨再生PCR芯片干細胞PCR芯片動脈粥樣硬化PCR芯片糖尿病PCR芯片趨化因子與受體PCR芯片,,生長因子PCR芯片炎癥細胞因子與受體PCR芯片干擾素及其受體PCR芯片Th1-Th2-Th3PCR芯片Toll樣蛋白受體信號轉導PCR芯片細胞外基質與粘連分子PCR芯片神經(jīng)營養(yǎng)素與受體PCR芯片低氧信號通路PCR芯片,,胰島素信號通路PCR芯片JAK/STAT信號通路PCR芯片MAPK信號轉導通路PCR芯片NF-kB信號通路PCR芯片一氧化氮PCR芯片Notch信號通路PCR芯片信號轉導通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片TGFb/BMP信號通路PCR芯片TNF配體及受體PCR芯片Wnt信號通路PCR芯片管家PCR芯片,第四節(jié)蛋白質芯片,,蛋白質芯片:又稱為蛋白質陣列或蛋白質微陣列(proteinmicroarray)蛋白質芯片是指在固相支持物上有序排列的各自獨立的多肽、蛋白或相應配體,利用蛋白質與蛋白質、蛋白質與DNA、蛋白質與RNA,或與其它配體間的相互作用,同時平行分析大量蛋白質的生物化學性質,在蛋白質組學基礎研究以及臨床診斷、藥物研究、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生等方面有廣闊的應用前景。,,是指以蛋白質分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列;用標記了熒光的蛋白質或其他它分子與之作用,洗去未結合的成分,經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度,來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關系。,,根據(jù)其固定生物分子的不同,可以分為受體配體檢測芯片,抗原芯片,抗體芯片等。根據(jù)芯片載體的不同,分為普通玻璃載玻片,多孔凝膠覆蓋芯片和微孔芯片3種主要形式。應用最普遍的是玻璃片,另外PVDF膜,聚丙烯酰氨凝膠,硝化纖維素膜,聚苯乙烯微珠,磁性微珠等對最普遍應用的玻璃片而言,用于制備蛋白質芯片的方法主要有戊二醛修飾法、聚賴氨酸修飾法、巰基修飾法和多糖修飾法等。,InteractionArrays——ProteinsonChip-LabelledSampleCaputureArrays——AntibodyonChip-LabelledSampleμELISAonArray——MiniaturisedSandwichAssaysReversedPhasedArrays——MultitudeofarrayedSamples,InteractionArrays,-Cloningandexpressionof6600yeastprotein-Complexarraysforprotein-proteininteractionstudiesZhuetal.(2001)Science.293,2101,CaptureArrays,SAMPLEARRAYSReversePhaseScreen,ANTIBODYARRAYSSampleLabellingApproaches,ANTIBODYARRAYSMutiplexedSandwichELISAs,,,,,,,,,SandwichImmunoassays,highlyparallelhighsensitivityexpensiveequipmentlabourintenseautomationdifficult,,,,,,,ReversePhaseProteinMicroarrays,YYYYYY,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ForwardPhaseDetectionAntigen,ReversePhaseDetection,CaptureMolecules,ImmobilizedAntigen,CaptureMolecules,,,,YYYY,,,,蛋白質芯片的核心技術是蛋白芯片的制備和反應信號的檢測分析。因此蛋白質的純度;蛋白質的固定是蛋白質芯片技術的重點和難點。由于蛋白質分子的活性依賴于不同的折疊方式,因此對芯片的表面修飾至關重要,要保證被點在芯片上的蛋白質不失活而又能牢固的固定在芯片上。,蛋白質芯片的原理,蛋白質芯片技術主要包括四個基本要點:芯片陣列的構建樣品的制備芯片生化反應信號檢測及分析,,首先將蛋白按設計的陣列方式點印在介質上,樣品蛋白質與芯片反應,然后用經(jīng)過標記的(可以是酶、熒光、同位素、生物素等)蛋白質與芯片-蛋白質復合物結合,通過激光共聚焦顯微鏡和CCD照相機對標記信號進行掃描分析。聯(lián)合應用雙向凝膠電泳,表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)或串聯(lián)質譜(MS/MS)還可以對蛋白分子進行定量分析。,,,提出生物學問題(實驗目的),樣品預處理(重組蛋白,制備一、二級抗體,熒光標記),生化反應化學偶合,加底物,反應溫度和時間,沖洗條件,檢測(熒光和比色掃描或拍照,參數(shù)設置),數(shù)據(jù)分析和建模圖象量化,標準化建立模型),1,2,3,4,5,蛋白質芯片制備,6,蛋白質芯片的分類,,蛋白質檢測芯片,蛋白質功能芯片,與基因芯片的比較:,蛋白質是基因表達的最終產(chǎn)物,接近生命活動的物質層面;探針蛋白特異性高、親和力強,可簡化樣品前處理,甚至可直接利用生物材料(血樣、尿樣、細胞及組織等)進行檢測;適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物;有助于了解藥物或毒物與其效應相關蛋白質的相互作用。,Proteinchip的應用(理論上),Diagnosticimmunoassaysimultaneoushigh-throughputanalysisofknownauto-antigens.Protein-ProteinInteraction.DNA-ProteinInteraction,Proteinchip的應用(具體的),微生物感染-病原體抗原、抗體的檢測自身抗體的檢測特定蛋白的檢測HLA分型過敏原檢測腫瘤標志的檢出,第五節(jié)組織芯片技術,組織芯片的優(yōu)點,高通量——短時(一次即獲大量信息)、高效(成百成千倍地提高效率),僅2CM2,含數(shù)十甚至數(shù)百例組織樣本,一次操作即可完成普通實驗所需的數(shù)十甚至數(shù)百次操作。,有助于減少實驗誤差——實驗條件保持一致,便于設置各種實驗對照,費用僅1/10-1/100,六個月——一年,一周,幾萬——幾十萬,一次一張玻片,上百個單位的珍貴試劑,一個單位的試劑,幾十次——上百張玻片,只需1/10︱1/100,組織芯片(意義),對人類基因組學、后基因組學的深入研究與發(fā)展特別表現(xiàn)在如下幾個方面:研究特定基因及其所表達的蛋白質與疾病之間的相互關系疾病的分子診斷預后指標的確定治療靶點的定位治療過程的追蹤與預測抗體和新藥物的開發(fā)和篩選基因治療的研發(fā)等方面,廣闊的應用前景,組織芯片(國內外現(xiàn)狀),國外起步階段組織獲取難產(chǎn)品數(shù)量少價格高、品種單一尚缺通行的行業(yè)標準種族差異實驗數(shù)據(jù)無法共享該技術的廣泛應用受阻礙,中國剛剛起步進展迅速組織學、遺傳學資源極其豐富國家重視科技部將組織芯片技術列為“十五”國家863技術攻關開發(fā)重大項目,組織芯片庫的構建,IHC流程圖,組織芯片,脫蠟水化,抗原修復,內酶封閉,位點封閉,加入一抗,加入二抗,,,,,,,,DAB顯色,二甲苯、酒精,,高壓、微波、煮沸、酶消化,,內源性過氧化物酶,,非特異性位點,,內源性生物素,,洗滌,,,洗滌,復染、脫水、透明、封片、閱片,,IHC,ISH流程圖,組織芯片,脫蠟水化,微波處理,胃酶消化,加預雜交液,進行雜交,封閉,,,,,,,,顯色,二甲苯、酒精,,非特異性位點,洗滌,,,洗滌,脫水、透明、封片、閱片,,,,insituhybridization,FISH流程圖,組織芯片,脫蠟水化,蛋白酶K消化,變性,D標探針雜交,FITC抗地高辛,,,,,,,顯色,二甲苯、酒精,,洗滌,,,洗滌,封片、閱片,,,洗滌,IS-PCR流程圖,組織芯片,脫蠟水化,蛋白酶K消化,RNase處理,原位擴增,原位雜交,,,,,,,,NBT-BCIP顯色,二甲苯、酒精,,洗滌,,,洗滌,脫水、透明、封片、閱片,,Primer底物DNA聚合酶,,堿磷酶標抗D,,洗滌,insituPCRonslides,藥物篩選流程,theend,,- 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