DHFR篩選原理.doc

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MSX加壓篩選與MTX加壓篩選 蛋氨酸亞氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)篩選用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系統(tǒng)壓力； 氨甲喋呤（amethopterin, MTX）篩選用的是二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系統(tǒng)壓力。 1. CHO細(xì)胞表達(dá)體系 常用的CHO細(xì)胞系有兩種：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氫葉酸還原酶的細(xì)胞株。CHO表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子；表達(dá)產(chǎn)物胞外分泌，便于分離純化；具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；貼壁生長(zhǎng)，有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)或在無(wú)血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度，培養(yǎng)體積能達(dá)到1000L以上；CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。 改造CHO細(xì)胞，可更好地表達(dá)外源蛋白。為減少大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中凋亡的發(fā)生，將bcl-2基因（細(xì)胞凋亡抑制基因）導(dǎo)入細(xì)胞，bcl-2基因的過(guò)量表達(dá)能抑制Gln或氧缺乏引起的細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞特定營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入p21、p27基因，可使細(xì)胞G1期延長(zhǎng)（細(xì)胞靜止），改造后細(xì)胞活力正常，營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒物含量有效降低，從而減少細(xì)胞凋亡、死亡，外源蛋白表達(dá)量提高，產(chǎn)品成本降低。 2. 載體系統(tǒng) 借助真核基因表達(dá)調(diào)控的理論，可將較強(qiáng)的順式作用元件集中到一個(gè)載體中，使其方便高效地表達(dá)外源基因。目前，已經(jīng)構(gòu)建了許多真核表達(dá)載體，它們包含適當(dāng)?shù)捻樖阶饔迷瓦x擇標(biāo)記。順式作用元件主要有啟動(dòng)子—增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄剪切和Poly A信號(hào)等；CHO細(xì)胞表達(dá)載體中主要有兩類選擇標(biāo)記：非擴(kuò)增基因和共擴(kuò)增基因。 2.1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子 啟動(dòng)子是影響外源基因表達(dá)效率的關(guān)鍵因素。作為表達(dá)載體元件之一，啟動(dòng)子既需強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，又應(yīng)具備較廣的應(yīng)用范圍。細(xì)菌的主要啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在動(dòng)物細(xì)胞中不起作用，所以大多從啟動(dòng)效率高且生物背景清楚的病毒基因組中分離得到。SV40、LTR和CMV啟動(dòng)子在CHO細(xì)胞中效果良好。有研究表明：在CHO細(xì)胞中，CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動(dòng)子和LTR啟動(dòng)子的10倍和30倍左右。來(lái)源于噬菌體的一些啟動(dòng)子，如T7啟動(dòng)子也可用于動(dòng)物細(xì)胞。除了病毒來(lái)源的啟動(dòng)子，現(xiàn)在熱衷于尋找細(xì)胞內(nèi)源性的啟動(dòng)子，如肽鏈延長(zhǎng)因子基因的啟動(dòng)子（EF-1α）、雞胞漿β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。EF-1α啟動(dòng)子是迄今應(yīng)用中最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一。目前商業(yè)化的表達(dá)載體中主要使用SV40、CMV和EF-1α啟動(dòng)子。 外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)受許多因素的影響，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面，其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細(xì)胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，由于在特定的細(xì)胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達(dá)主要取決于其順式作用元件的作用。對(duì)外源基因而言，也就是決定于特定的表達(dá)載體中的啟動(dòng)子，一個(gè)合適的啟動(dòng)子可將外源基因的表達(dá)水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對(duì)于特定的基因和細(xì)胞，各啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別，因此我們認(rèn)為在進(jìn)行外源基因的表達(dá)研究中，應(yīng)考慮選用幾種不同的強(qiáng)啟動(dòng)子，才有可能獲得較為理想的表達(dá)效果。與啟動(dòng)子相連的是增強(qiáng)子元件，具種、組織特異性，CHO細(xì)胞中一般采用SV40和CMV增強(qiáng)子。 2.2選擇標(biāo)記和基因擴(kuò)增 CHO細(xì)胞表達(dá)載體主要有兩類選擇標(biāo)記。一類是neo等非擴(kuò)增基因，它對(duì)目的基因的拷貝數(shù)沒(méi)有影響，用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體。另一類具有基因擴(kuò)增的功能，也稱共擴(kuò)增基因，如二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。 外源基因在CHO細(xì)胞中擴(kuò)增是提高表達(dá)水平的重要策略之一。dhfr基因擴(kuò)增系統(tǒng)最常用，當(dāng)攜帶dhfr基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，或攜帶dhfr基因的標(biāo)志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞后，可以得到在選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不斷提高M(jìn)TX濃度，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來(lái)的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。進(jìn)行性選擇抗氨甲喋呤的細(xì)胞系，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致與dhfr串聯(lián)在一起的外源基因的共擴(kuò)增，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達(dá)，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時(shí)被擴(kuò)增。但它也有缺陷，表達(dá)細(xì)胞僅限dhfr缺陷型細(xì)胞，重復(fù)篩選抗性細(xì)胞費(fèi)時(shí)費(fèi)力，去除選擇壓力后，擴(kuò)增基因不穩(wěn)定。細(xì)胞遺傳學(xué)表明，在選擇壓力下，擴(kuò)增基因的大小和結(jié)構(gòu)處在不斷變化之中。在細(xì)胞分裂的不同時(shí)間，不同的宿主細(xì)胞和選擇藥物使基因的擴(kuò)增范圍處于不斷變化之中，從100～1000kb。即使是同一種細(xì)胞，選擇過(guò)程不同，基因擴(kuò)增的范圍也不同。谷氨酰胺合成酶（GS）擴(kuò)增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴(kuò)增效率，但細(xì)胞長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)狀況不佳，DHFR系統(tǒng)表達(dá)水平雖較GS系統(tǒng)低，但細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定。 基因擴(kuò)增還可通過(guò)弱化選擇標(biāo)記基因表達(dá)來(lái)達(dá)到。弱化選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，在使用與常規(guī)的表達(dá)載體相同的選擇壓力時(shí)，dhfr基因拷貝數(shù)更高，外源基因的表達(dá)水平也得到提高。如一種雙順?lè)醋虞d體將dhfr基因連在外源基因的3′端，從而位于外源基因3′端下游的dhfr基因的翻譯起始效率大大降低，dhfr基因表達(dá)被弱化。另一種載體將dhfr基因插入人工合成的內(nèi)含子內(nèi)部，兩邊為剪接供體SD和剪接受體SA，外源基因在內(nèi)含子的下游，mRNA剪切時(shí)，95%的dhfr mRNA被剪切掉。也有一些表達(dá)質(zhì)粒不含選擇基因，則必須共轉(zhuǎn)染一個(gè)可表達(dá)選擇基因的標(biāo)志質(zhì)粒，如pSV dhfr,該質(zhì)粒由Psv2 dhfr去除SV40的增強(qiáng)子構(gòu)建而成，起到弱化dhfr基因表達(dá)的作用。 2.3其它 表達(dá)載體引入天然或人工合成的內(nèi)含子序列，有利于外源基因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA剪接內(nèi)含子，增加穩(wěn)定性，提高翻譯效率，許多真核表達(dá)載體帶有SV40的內(nèi)含子。但因大多數(shù)插入的外源基因是cDNA，所以一般也用不著剪接信號(hào)。真核基因的mRNA加工需要多聚腺苷酸加尾信號(hào)（pA），實(shí)驗(yàn)表明，除去pA后，外源蛋白表達(dá)量降低90%。目前多采用SV40的晚期及早期pA、牛生長(zhǎng)素基因的pA和人工合成的pA。 3. 外源基因 啟動(dòng)子之后是克隆的基因組DNA或cDNA?；蚪MDNA比cDNA表達(dá)量要高，應(yīng)盡量使用基因組DNA。除此之外，可以通過(guò)下列方法增加外源基因的表達(dá)量：(1)在基因起始密碼子的前后設(shè)置Kozak序列，即GCCGCCA-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的嘌呤。具有Kozak序列與否，翻譯起始強(qiáng)弱會(huì)有一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異；(2)盡量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低轉(zhuǎn)錄、翻譯時(shí)不必要的能量消耗，另一方面減少5′未翻譯前導(dǎo)區(qū)和克隆中的GC尾部對(duì)表達(dá)水平的不良影響，以及減少3′未翻譯區(qū)對(duì)mRNA穩(wěn)定性的不良影響； (3)拼接一個(gè)重組蛋白的信號(hào)前導(dǎo)肽，它可以有效地指導(dǎo)合成、分泌蛋白的輸出等；(4)在不改變蛋白氨基酸序列的前提下，修飾個(gè)別基因的編碼序列，解決密碼偏性問(wèn)題。實(shí)際表達(dá)中，可根據(jù)表達(dá)效果，對(duì)基因加以改造，以提高表達(dá)量。 4. 表達(dá)克隆的篩選 不同的細(xì)胞克隆，外源蛋白表達(dá)水平高低不同，原因可能有二方面，一是外源質(zhì)粒片段整合入細(xì)胞染色體的位置不同，有的區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性高，有的轉(zhuǎn)錄活性低；二是不同的細(xì)胞克隆，質(zhì)粒的拷貝數(shù)是不同的。挑選高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株一般采用兩種流程：第一種方案首先通過(guò)檢測(cè)外源基因的表達(dá)，逐一篩選dhfr陽(yáng)性單克隆，再轉(zhuǎn)到濃度持續(xù)升高的MTX之下生長(zhǎng)，分別進(jìn)行擴(kuò)增；另一種方法先把dhfr陽(yáng)性單克隆合并，在不斷升高的MTX之下加壓擴(kuò)增外源基因的表達(dá)，最后挑出穩(wěn)定的、高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。加壓擴(kuò)增外源基因表達(dá)，除了單純使用dhfr擴(kuò)增系統(tǒng)或GS擴(kuò)增系統(tǒng)外，也可采用G418與MTX聯(lián)合作用細(xì)胞，G418與MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）聯(lián)合作用細(xì)胞，或者利用dhfr擴(kuò)增系統(tǒng)與GS擴(kuò)增系統(tǒng)共加壓。 混合克隆的表達(dá)水平遠(yuǎn)趕不上表達(dá)較高的單個(gè)克隆，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中存在不表達(dá)或低表達(dá)的非生產(chǎn)細(xì)胞，并可在長(zhǎng)期生存，甚至MTX加壓時(shí)占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，排斥其它高表達(dá)細(xì)胞，成為細(xì)胞群體中的主要部分，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降，并對(duì)MTX加壓無(wú)反應(yīng)。當(dāng)撤除MTX，會(huì)發(fā)生外源蛋白表達(dá)量下降的情況，原因也可能在此。 5. 工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點(diǎn)，一是研究對(duì)象是活的細(xì)胞，可長(zhǎng)時(shí)期地監(jiān)控、檢測(cè)甚至定量評(píng)估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)等；二是可以人為地嚴(yán)格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生物等外界因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達(dá)到比較均一性。常用的細(xì)胞系均是性質(zhì)均一的細(xì)胞，需要時(shí)還可采用克隆化等方法使細(xì)胞進(jìn)一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄。體外培養(yǎng)的細(xì)胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實(shí)驗(yàn)的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費(fèi)用相對(duì)經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。 然而，細(xì)胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細(xì)胞脫離了機(jī)體復(fù)雜的環(huán)境條件，其細(xì)胞形態(tài)和功能都會(huì)發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細(xì)胞視為一種既保持動(dòng)物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體。 由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是其他實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對(duì)于分子生物學(xué)家及細(xì)胞生物學(xué)家而言，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)感興趣的基因產(chǎn)物進(jìn)行定位、運(yùn)動(dòng)及功能研究變得越來(lái)越重要。在克隆一個(gè)基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細(xì)胞，以分析其表達(dá)，測(cè)定表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，或?qū)⒏弑磉_(dá)的基因產(chǎn)物純化。 5.1 血清 利用含血清培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白制品有許多不利，如增加培養(yǎng)成本和污染機(jī)會(huì)，增加純化難度和成本，增加產(chǎn)品質(zhì)控指標(biāo)。因此，大規(guī)模生產(chǎn)臨床使用的生物制品，應(yīng)盡量減少血清的用量，最好用無(wú)血清培養(yǎng)基取代。為此，應(yīng)盡可能增加大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的接種密度，以縮短生長(zhǎng)延滯期，提高細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。如果接種密度較低時(shí)，在培養(yǎng)開(kāi)始階段，可使用含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到一定濃度(如>106/ml)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再降低血清濃度或使用無(wú)血清培養(yǎng)基。外源蛋白的實(shí)際產(chǎn)量無(wú)明顯下降。許多實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速度相對(duì)降低時(shí)，產(chǎn)物的比生長(zhǎng)速率提高，原因可能是用于細(xì)胞增殖的能量減少，有利于外源蛋白的生產(chǎn)。 使用無(wú)血清培養(yǎng)墓代替含血清培養(yǎng)基，可克服血清帶來(lái)的弊端。但失去血清中的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，密度降低，生存周期縮短，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)最下降。因此，往往通過(guò)增加無(wú)血清培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)，提高蛋白表達(dá)。用作血清替代成份的種類很多，大致可分為激素和生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子及低分子量營(yíng)養(yǎng)因子四類。有研究報(bào)道，添加BSA對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用顯著，丙酮酸鈉、腐胺、丁酸鈉有利于表達(dá)目的產(chǎn)物。不同的CHO工程細(xì)胞的培養(yǎng)基添加成份可能存在差異，一般需要自己進(jìn)行摸索最優(yōu)條件。 5.2 氧氣和二氧化碳 一般認(rèn)為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溶氧在10%~60%之間，過(guò)高可損傷細(xì)胞膜甚至DNA，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而溶氧過(guò)低又會(huì)改變細(xì)胞的代謝，降低細(xì)胞蛋白表達(dá)水平，甚至因缺氧而導(dǎo)致細(xì)胞逐漸死亡。胡顯文等在利用多孔微載體大規(guī)模培養(yǎng)CHO細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶氧維持在20%~45%時(shí)，對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物和葡萄糖代謝無(wú)明顯影響，但溶氧降至7%~9%時(shí)，細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低，葡萄糖代謝轉(zhuǎn)化為乳酸 的比例上升，培養(yǎng)基的有效利用率明顯降低。 隨著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和密度的增大，可導(dǎo)致CO2積聚，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中，最適CO2水平為4%~10%。當(dāng)達(dá)到14%時(shí)便會(huì)阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)。高CO2分壓使重組CHO細(xì)胞系的生長(zhǎng)和組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)產(chǎn)率均受到抑制，而且t-PA糖鏈中包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的唾液酸比例稍下降。 5.3 氮和乳酸 氨和乳酸是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的主要代謝副產(chǎn)品。與乳酸相比，較低濃度的氨就會(huì)對(duì)重組CHO細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，最終的細(xì)胞密度隨著氨濃度的提高而降低。氨來(lái)源于兩方面：一是直接來(lái)源于培養(yǎng)基，一是細(xì)胞代謝產(chǎn)生。二者都涉及谷氨酸胺，因此需要防止培養(yǎng)基中Gln自然分解，限制Gln用量，并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。乳酸是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物，高濃度的乳酸也會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。氨和乳酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用在多種不同的細(xì)胞系均存在，不同細(xì)胞系對(duì)于這兩種代謝產(chǎn)物的耐受性差別很大，原因可能是不同細(xì)胞系葡萄糖和谷氨酰胺代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的敏感性不同，或者在不良的生長(zhǎng)環(huán)境下，氨基酸代謝發(fā)生改變。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，因此降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以及減少乳酸產(chǎn)生的同時(shí)，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。 6. 問(wèn)題和展望 外源蛋白在CHO細(xì)胞中表達(dá)的影響因素非常復(fù)雜，建立穩(wěn)定、高效表達(dá)的重組CHO細(xì)胞系并非易事。目前主要存在問(wèn)題如下：重組CHO細(xì)胞生產(chǎn)效率低；某些糖基化表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化；重組CHO細(xì)胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)為上游構(gòu)建時(shí)著重考慮它的高效表達(dá)，而對(duì)產(chǎn)物的分離純化過(guò)程考慮較少；重組細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)用昂貴，自動(dòng)化水平低下。 重組蛋白在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)是一個(gè)涉及多學(xué)科的問(wèn)題，需多個(gè)研究領(lǐng)域的共同合作探討?？蒲腥藛T可能把以下問(wèn)題作為今后的主攻方向：提高表達(dá)水平，如尋找一些新的強(qiáng)啟動(dòng)子和合適的增強(qiáng)子、在載體上裝配適合基因高效表達(dá)的必要元件、根據(jù)CHO細(xì)胞翻譯特點(diǎn)，調(diào)整外源基因密碼子等；注重分離純化的問(wèn)題，如改變DNA中的個(gè)別序列，使表達(dá)產(chǎn)物在不影響生物活性的前提下，攜帶有利于分離純化的基因；細(xì)胞培養(yǎng)的低成本、高密度、高產(chǎn)量和培養(yǎng)設(shè)備的大型化，自動(dòng)化、精巧化；分離純化的低成本和高活性回收率等方面。 討論 有些天然的具有生物活性的蛋白類物質(zhì)，在人類疾病的治療中發(fā)揮著巨大的作用。但是這些活性物質(zhì)，有些在自然界中含量很少，滿足不了人們的需要；有些含異源蛋白太多，純化難度大等缺點(diǎn)，基因工程藥物的產(chǎn)生解決了這些難題，具有跨時(shí)代的意義，是生物技術(shù)水平發(fā)展的重要標(biāo)志之一。重組蛋白質(zhì)藥物具有活性高、用量少、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外生物藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。 細(xì)胞表達(dá)源蛋白最重要的是要保持其天然結(jié)構(gòu)及活性。而早期的原核表達(dá)系統(tǒng)不能分泌有活性的蛋白，都是以內(nèi)涵體的形式存在的，真核表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)榫哂修D(zhuǎn)錄后的修飾加工功能，包括蛋白折疊、二硫鍵形成、亞基多聚化、肚鏈裂解、蛋白磷酸化以及N型和O型糖基化等，因而表達(dá)的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面更接近于天然的蛋白分子，具有生物活性，可分泌胞外。CHO細(xì)胞是外源蛋白表達(dá)運(yùn)用得較為成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其用于外源基因表達(dá)也具有很多優(yōu)點(diǎn)，如外源基因能夠穩(wěn)定整合于細(xì)胞染色體內(nèi)，易于規(guī)模化培養(yǎng)等。 由于CHO-dhfr-細(xì)胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無(wú)法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過(guò)目的基因與dhfr基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，更為重要的是由于dhfr可被葉酸類似物MTX所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因必須擴(kuò)增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細(xì)胞系；又由于與dhfr基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細(xì)胞染色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著dhfr基因的擴(kuò)增而擴(kuò)增，我們就得到了能大量表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞克隆，這在基因工程抗體及各種基因工程蛋白的表達(dá)中是可行度很高的一種措施。 上面也提到影響重組蛋白在CHO細(xì)胞中表達(dá)的因素很多，涉及CHO細(xì)胞表達(dá)體系、表達(dá)載體系統(tǒng)、外源基因、表達(dá)細(xì)胞株的加壓擴(kuò)增與篩選、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)等。我認(rèn)為表達(dá)載體的構(gòu)建是影響細(xì)胞能否表達(dá)的關(guān)鍵問(wèn)題，因?yàn)閐hfr基因及鄰近區(qū)段染色體DNA拷貝數(shù)是共擴(kuò)增的關(guān)系，因此必須將外源基因片段整合到dhfr基因的上游或者下游，位置不能太遠(yuǎn)，否則無(wú)論如何篩選也得不到表達(dá)外源基因產(chǎn)物的細(xì)胞，因此說(shuō)它是能否表達(dá)的關(guān)鍵，當(dāng)然其它步驟也不能忽略，如CHO-dhfr-細(xì)胞轉(zhuǎn)染、使用強(qiáng)啟動(dòng)子等。如果構(gòu)建成功可以產(chǎn)生外源蛋白，那么篩選高表達(dá)的細(xì)胞株等操作就是提高外源蛋白表達(dá)量的問(wèn)題，使外源蛋白高效表達(dá)，也是很有意義的，為大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。 MTX篩選擴(kuò)增系統(tǒng)，常需在MTX選擇壓力下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的篩選。因此MTX加壓篩選是需要時(shí)間和耐心的，但是細(xì)胞培養(yǎng)的條件要合適，如培養(yǎng)基的選用（CHO細(xì)胞一般采用F-12培養(yǎng)基），營(yíng)養(yǎng)成分的適量（L-谷氨酰胺），培養(yǎng)液的新鮮等，首先要保證細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和存活，這樣才能縮短加壓篩選的周期。另外也要等細(xì)胞適應(yīng)這個(gè)壓力并恢復(fù)正常生長(zhǎng)后再繼續(xù)加壓，提高M(jìn)TX濃度，可以成倍數(shù)遞增，待細(xì)胞適應(yīng)新的壓力并恢復(fù)正常生長(zhǎng)時(shí)再繼續(xù)，同時(shí)還要保存每個(gè)MTX濃度下的細(xì)胞種子。因?yàn)樵诖撕蟮募?xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，隨著MTX的撤離和細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)染細(xì)胞高表達(dá)抗體的能力常會(huì)逐漸下降甚至喪失。因此，即使是來(lái)源于同一細(xì)胞株的各個(gè)亞克隆細(xì)胞之間，其抗體表達(dá)量也常不均一。CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的這種不穩(wěn)定性，可能是由于細(xì)胞內(nèi)外源基因拷貝數(shù)的丟失或轉(zhuǎn)錄效率下降等所致。對(duì)此尚有待進(jìn)行深入地研究。但這一現(xiàn)象提示，在篩選建株的早期，應(yīng)采取措施及早鑒定各個(gè)細(xì)胞克隆表達(dá)的穩(wěn)定性，并及時(shí)大量保存穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞種子，或適時(shí)地對(duì)細(xì)胞株用MTX再加壓和克隆化篩選，以保持轉(zhuǎn)染細(xì)胞高表達(dá)抗體的能力。應(yīng)及時(shí)用MTX對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行再加壓篩選，以保持細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)抗體的能力。 有報(bào)道稱加壓方式對(duì)表達(dá)量的提高和細(xì)胞株表達(dá)的穩(wěn)定性有較大的影響。小梯度多次加壓有利于最終得到高表達(dá)細(xì)胞株，且細(xì)胞株表達(dá)穩(wěn)定，比大幅度快速加壓能夠得到表達(dá)水平更高的克隆。大幅度加壓可以在短期內(nèi)得到高表達(dá)克隆株細(xì)胞，但是最終表達(dá)水平并不比小幅度多次加壓得到的細(xì)胞株表達(dá)量高，而且細(xì)胞株表達(dá)往往不穩(wěn)定，在撤掉篩選壓力后，表達(dá)水平往往下降。在大幅度加壓篩選過(guò)程中，可能由于種種原因dhfr基因發(fā)生突變，突變后的DHFR對(duì)MTX的親和力降低，因而突變細(xì)胞株的基因擴(kuò)增倍數(shù)也低，目的基因無(wú)法高表達(dá)，更易產(chǎn)生非生產(chǎn)性克隆。