2019-2020年高中生物選修1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 學(xué)案.doc

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2019-2020年高中生物選修1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 學(xué)案 [導(dǎo)學(xué)誘思] 1．PCR原理 填寫下列表格 參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用 解旋酶 DNA母鏈 合成子鏈的原料 DNA聚合酶 引物 DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為 ，而磷酸基團(tuán)的末端稱為 。DNA聚合酶不能 開始合成DNA，而只能 ，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是 。 在DNA的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是 。在體外可通過控制 來實(shí)現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為 。PCR利用了DNA的 原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來 的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。 PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供： ， ， ， ，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 2．PCR的反應(yīng)過程 PCR一般要經(jīng)歷 循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由 延伸而成的DNA單鏈會與 結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能 ，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。 3．實(shí)驗(yàn)操作 在實(shí)驗(yàn)室中，做PCR通常使用 ，它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí)，用微量移液器，按PCR反應(yīng)體系的配方在 中依次加入各組分，，再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序即可。 4．操作提示 為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行 。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在 儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，移液管上的槍頭要 。 [疑難點(diǎn)撥] 1.PCR技術(shù)簡介 PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等各方面。 2．細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用 ①解旋酶：打開DNA雙鏈 ②DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板 ③4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料 ④DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈 ⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3，端開始連接脫氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對。用于PCR的引物長度通常為20—30個(gè)核苷酸） 3．DNA的合成方向 DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為3，端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5，端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3，端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3，端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5，端向3，端延伸。 4．PCR的反應(yīng)過程 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性（當(dāng)溫度上升到90oC以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈）、復(fù)性（溫度下降到50oC左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合）和延伸（溫度上升到72oC左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈）三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。 5．PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制 PCR反應(yīng)是通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反應(yīng)的題目與DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段。（230） [典例解析]] 一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的（ ） A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25 答案：C 解析：一個(gè)DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為2n。而DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，其特點(diǎn)是：新形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是新形成的子鏈。這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中，這樣兩個(gè)子代DNA分子被標(biāo)記了。以后均是在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，不論經(jīng)過多少次復(fù)制，最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個(gè)DNA分子中，這樣經(jīng)過n次循環(huán)后，標(biāo)記的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。