微生物菌種高通量篩選技術與裝置.ppt

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華東理工大學國家生化工程技術研究中心(上海)王永紅2011.11.24,微生物菌種高通量篩選技術與裝置,內容提綱,高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術與裝備國際進展高通量篩選技術應用示范,高通量篩選在微生物育種中的重要意義,1、菌種是發(fā)酵技術的源頭2、菌種是發(fā)酵技術的核心之核心3、菌種提高不增加設備材料投入,菌種發(fā)酵水平是企業(yè)產品市場競爭力的體現(xiàn),青霉素：5萬——12萬u/ml（國內）8萬——20萬u/ml（國外）紅霉素：5000——8000/10000u/ml（國內）10000——15000u/ml（國外）阿維菌素：4000——8400u/ml（國內）10000u/ml以上（國外）,案例,育種工作中兩大任務：突變與篩選,高通量篩選在微生物育種中的重要意義,突變僅是前提篩選才是關鍵,,我國現(xiàn)有菌種篩選儀器裝備與技術國際相比存在巨大差距我國：傳統(tǒng)方法，篩選方式半個世紀沒有明顯改進國際：高通量篩選技術(Highthroughputscreening,HTS),高通量篩選在微生物育種中的重要意義,,,內容提綱,高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術與裝備國際進展高通量篩選技術應用示范,1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的發(fā)現(xiàn)56名科學家、10萬份土樣、歷時1年25%市場1984年，Pfizer提出AutomationProject.1990年，在Nagoya,Japan實施1萬株份/周,高通量篩選技術的起源,,微生物菌種篩選一般流程概率事件,菌種高通量篩選技術與裝備國際進展,通量限制步驟,微生物菌種篩選儀器裝備發(fā)展趨勢：自動化、微型化、高通量培養(yǎng)基滅菌、分裝；倒平板；挑取單菌落、接種；培養(yǎng)；目的產物抽提；測定；數(shù)據(jù)收集處理等過程單元自動化與系統(tǒng)集成自動化（通量匹配）,菌種高通量篩選技術與裝備國際進展,,FillingUnit分裝速率：400-1200dishes/h分裝量：4-45ml/0.5-0.6sec平動規(guī)格：直徑92-98mm可調高度15-21mm可調滅菌方式：253.7nm紫外線滅菌尺寸重量：45cm(L)*30cm(D)*61cm(H),15kg★StackingUnit堆疊速率：可調，與輸送機自動配合。堆疊高度：2-15板平皿，可調堆疊桌面：500500mm可擴充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg,全自動培養(yǎng)基分裝系統(tǒng),750皿/小時,自動滅菌培養(yǎng)基制備機,,,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復篩,工藝,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測,,自動細菌平板稀釋儀,4600個克隆/小時,,培養(yǎng),,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復篩,工藝,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測,,,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復篩,工藝,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測,,培養(yǎng)基分裝,,,,,傳統(tǒng)方法,,高通量方法：96、384、1536/min,,傳統(tǒng)方法：1-2/min（分光光度計）1/15-30min（HPLC）,,,,,,,出發(fā)株,誘變等,10倍稀釋,涂平板,單菌落,初篩,復篩,驗證,放大,接種,倒平板,培養(yǎng)基,保藏,活化,前處理,檢測,培養(yǎng)基分裝,,,,,1微孔板式反應器2微流控式芯片實驗室3搖瓶形式的微型反應器,1,2,3,2056valves,256compartmentscontainingbacterialexpressinganenzyme,24個，5ml,12個，30ml,24個，1ml,多通道多參數(shù)微型反應器,動物細胞培養(yǎng)用微型反應器,左圖4.92.32.2m，整個箱體有溫濕度控制，箱體內，條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計、離心機、冷藏室等。平行地實現(xiàn)樣品準備、運行、監(jiān)控768個（16個48孔板）。,系統(tǒng)集成自動化：四個層次,,Orbitor工作站,重量輕only55lbs.只有25公斤高可靠性Collisiondetection&recovery沖突檢測與恢復Platesensinginthegripper微孔板傳感器Servogripper–doesnotdropaplatewhenthepowergoesout!伺服抓板手-即使停電也不會讓一個板子掉落運送一塊板子只需4秒鐘Bi-directionaltelescopingarm雙向伸縮手Unlimited3600rotation無限360度轉動Nohardstops無急停死角Motionblending運動混合smoothmovements平穩(wěn)移動,Orbitor結構剖解,Bi-directionaltelescopingarm雙向伸縮抓板手Rotatingbase旋轉平臺Internalre-grip內部固定裝置Hotelmountx4板子堆棧*4,1.,4.,3.,2.,操作靈活性,PCdriven微機控制Nocontrollerrequired無需其它控制裝置Add-onstoragecapability可搭配存儲能力Smallfootprint小的占地空間和軌跡Feedupto4instrumentswithease可連接4臺儀器Fitswithinawidevarietyofbiosafetycabinets適應多種型號的生物安全柜,內容提綱,高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術國際進展高通量篩選技術應用示范,高通量篩選技術,Scaleup,,,Scaledown,微型化,高通量,標準化,對高通量篩選技術存在認識上的誤區(qū),認為微型化只要按比例縮小即可，忽略參數(shù)相關性問題；對操作條件的平行性沒有足夠的認識僅注重培養(yǎng)環(huán)節(jié)高通量，忽略其他步驟匹配和瓶頸的轉移問題對標準化重于最優(yōu)化的認識不足高通量篩選是提高成功幾率的一種技術手段,菌種高通量篩選技術組成,菌種高通量篩選技術,通量匹配,限制瓶頸在不斷克服和轉移,菌種高通量篩選技術,菌種高通量篩選技術是一整套高通量技術的有機整合和合理匹配,紅霉素生產菌株的微型化培養(yǎng)及分析,微型化培養(yǎng),就搖瓶與微孔板之間的生理發(fā)酵參數(shù)和動力學參數(shù)進行了研究，以證實微型化培養(yǎng)方法的可行性，為紅霉素產生菌高通量篩選奠定了基礎。,微型化培養(yǎng)--動力學參數(shù)比較,2.1氧氣傳遞系數(shù),2.2物料混合,流場特性,OTR與混合,三、國家生化工程中心的高通量篩選工作基礎,,,,微型化培養(yǎng)--發(fā)酵參數(shù)比較,2.3生物效價,2.4總糖的對應性實驗,微型化培養(yǎng)--發(fā)酵參數(shù)比較,2.5還原糖的對應性實驗,2.6生物量,微型化培養(yǎng)--裝置圖,種子（挖塊）,發(fā)酵（孔徑2cm）,微型化分析,建立與微型化發(fā)酵培養(yǎng)配套的檢測方法，才能真正意義上實現(xiàn)篩選的高通量。生物檢測法化學檢測法,生物檢測法,生物檢定法又分管碟法和比濁法兩種，管碟法是最常用的生物檢定法，也是我國2005版之前藥典收錄的唯一一種微生物檢定法。與管碟法比較，比濁法具有快速(檢驗僅需3～4h)、易于操作、采用液體培養(yǎng)法、無擴散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點，適用于絕大部分抗生素和含抗生素樣品的含量測定。,化學檢測法,紅霉素分子在酸性條件下水解生成黃色絡合物，此顏色與含量成正比，符合朗格爾比色定律。,紅霉素檢測方法,微型化分析--生物檢測法,微量比濁法測定紅霉素生物效價的可行性,微型化分析--生物檢測法,微型化分析--生物檢測法,檢驗96孔板的準確度與精密度,微型化分析--化學檢測法,,紅霉素化學效價測定結果比較,微型化分析--化學檢測法,樣品前處理對紅霉素效價檢測的影響分析,微型化分析--化學檢測法,,高通量化學檢測方法驗證,標準品加入法是在樣品溶液中加入一系列梯度標準溶液進行顯色測定，然后按照繪制標準曲線的步驟測定吸光度,繪制吸光度-加入濃度曲線,用外推法求得樣品溶液的濃度。兩條直線切入橫座標上所間的距離，即是樣品中紅霉素的化學效價，為47.8μ/ml，標準曲線法測定的結果為48.02μ/ml，相對標準偏差為0.00324,Y1=0.0046X-0.0164,Y2=0.0046X+0.2202,高通量（微型化）抗生素效價分析方法,生物效價高通量分析方法：基于比濁法原理設計生物效價高通量分析方法，使分析時間從20多小時縮短到4小時，分析樣品量從1ml降到10ul，鑒定菌培養(yǎng)基從30ml降到90ul，一次檢測樣品數(shù)量可達到成百上千份，而且僅需1人操作，傳統(tǒng)生物效價分析，每天每人分析樣品數(shù)量50份左右。?化學效價高通量分析方法：開發(fā)了可以與自動化液體處理工作站相匹配的微量化化學分析路線，篩選通量更高，樣品檢測體積更小，反應體積從20ml降到500ul，檢測體積從5ml降到100ul，分析時間更短，1小時之內完成上千份樣品分析。?,微型化平臺應用,單菌落培養(yǎng),高通量培養(yǎng)技術,裝液量：500—2000ul,24孔,48孔,96孔,固體培養(yǎng)和菌種保藏,可滅菌、重復使用壽命長、成本低、易清洗、能統(tǒng)一標準、防交叉污染、透氣性好、防止水分蒸發(fā),孔板蓋,微孔板固定架,板數(shù)：882＝128,孔數(shù)：12824＝307212848＝614412896＝12288,多通道可調深孔板取樣適配器,專用菌落瓊脂柱打孔器,微型化平臺應用,對誘變后96個菌株分別進行搖瓶培養(yǎng)和微型化培養(yǎng)，5天后測定其生物活性，結果如圖。,微型化平臺應用,微型化平臺應用,總結：高通量篩選技術的優(yōu)勢（1）,操作平行性結果可比性效率(一周到一個月完成常規(guī)方法一年的工作量)成本：人力、時間、空間、經濟,總結：高通量篩選技術的優(yōu)勢（2）,1.高產菌株的篩選數(shù)量性狀：1—多關系，無模型，依靠篩選數(shù)量如：賴氨酸高產菌株篩選質量性狀：0—1關系，有模型，無需龐大篩選數(shù)量。如：賴氨酸缺陷菌株篩選其他：各種氨基酸、有機酸、維生素、抗生素、生物基產品等高產篩選,總結：高通量篩選技術的優(yōu)勢（3）,2.發(fā)酵原材料（培養(yǎng)基）的生物檢驗直接檢驗原材料的應用效果精細調節(jié)原材料的配比和用量不同原材料與菌株的對應關系特點：建立原材料數(shù)據(jù)庫和菌株數(shù)據(jù)庫長期性、基礎性工作,謝謝！,