基因工程的基本操作程序 PPT課件

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1.2 基因工程的基本操作程序,原理：基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。（既是概念，又是原理）,基因重組,1,,,,,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,2,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指______________________,編碼蛋白質的結構基因,2、獲取目的基因的常用方法有哪些?,（3）人工合成,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術擴增,3,(一)從基因文庫中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫,1.基因文庫,4,,基因組文庫與部分基因文庫的關系,,怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,5,① 概念：PCR全稱為_______________，是一項 在生物____復制___________的核酸合成技術,③條件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.,②原理：__________,④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循 環(huán)的次數(shù)）,⑤結果：,聚合酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA復制,已知基因的核苷酸序列,四種脫氧核苷酸,一對引物,耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增,(二)利用PCR技術擴增目的基因,6,⑥過程：,a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_____斷裂，形成___________,b、退火（復性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結合，形成局部________。,c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從 引物處延伸，合成與模板互補 的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,7,8,（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因,DNA合成儀,蛋白質的氨基酸順序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,,,,推測,推測,合成,當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。,9,二、基因表達載體的構建——基因工程的核心,目的：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,10,2、表達載體的組成 啟動子 終止子 目的基因 標記基因等,,11,,質粒,,目的基因,,限制酶,,12,,質粒,DNA分子,,限制酶處理,,,一個切口 兩個黏性末端,兩個切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質粒）,,—— 核心,同一種,二、基因表達載體的構建,3.過程:,13,,,14,1、將目的基因導入植物細胞的方法：農桿菌轉化法 （1）農桿菌特點： （2）原理、過程,三、將目的基因導入受體細胞,雙子葉植物,15,,,,,16,2、將目的基因導入動物細胞 （1）方法：顯微注射法 （2）程序：,(三)將目的基因導入受體細胞,目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,,,,,,17,18,3、將目的基因導入微生物細胞,（1）原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少 （2）方法：Ca2+處理,用Ca2+處理細胞 感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收DNA分子,,,,19,(四)目的基因的檢測與鑒定,——檢查是否成功,檢測— (分子 水平),鑒定—— （個體水平）,,①檢測轉基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因 復制,②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定,方法——,方法——,方法——,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,病原體感染法 (接種實驗法),,,,20,（二）個體水平,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。,21,22,,,,23,,,24,思考與探究,1、不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用， 還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須 構建上述元件的主要理由是： （1）生物之間進行基因交流，需使用啟動子和終止子才能比較有 利于基因的表達。如通過CDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子， 只將編碼序列導入受體生物中，此目的基因無法進行轉錄。 （2）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記。 （3）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控 元件，如增強子等。 （4）有時需要目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往 要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的 融合基因），如綠色熒光白基因等。,25,思考與探究,2、農桿菌中不同的菌株侵染能力有差別，在基因工程中需要加以 選擇使用。利用農桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加 上酚類化合物，（也就是說單子葉植物不能合成酚類化合物） 對于單子葉植物不同的種類，農桿菌侵染進行遺傳轉化的效果也有 很大差異。 如果想將一個抗病基因轉入小麥，也可以用農桿菌，但要注意兩點 ?要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可在 侵染單子葉植物； ?要加趨化和誘導的物，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農桿菌向 植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的Vir區(qū)（誘導性） 的基因，使T-DNA轉移并插入到染色體DNA上。,26,思考與探究,3、有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網(wǎng)和 高爾基體復合體上加工完成的，內質網(wǎng)和高爾基體復合體存在于真 核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生 產這種糖蛋白是不可能的。,4、基本操作如下。 （1）從小鼠中克隆出β－珠蛋白基因的編碼序列（CDNA） （2）將 CDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另入加上 抗四環(huán)素的基因，構建成一個表達載體。 （3）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán) 素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸菌中，大腸 桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌 菌落，則表明β－珠蛋白基因已進入其中。 （4）培養(yǎng)進入了β－珠蛋白基因的大腸桿菌收集菌體，破碎后從中 提取β－珠蛋白。,27,1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,練習,28,2）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內切酶,A,練習,29,3）有關基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質粒的形成在細胞內完成 C、質粒都可作為運載體 D、蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料,D,練習,30,4）基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結合 C、將目的基因導入受體細胞 D、目的基因的檢測和表達,C,練習,31,