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用羥基磷灰石薄膜給予水凝膠細(xì)胞黏附力
摘要：為了給予多水凝膠(PVA-H)良好細(xì)胞黏附力作為人工關(guān)節(jié)軟骨, 通過關(guān)于PVA-H的脈沖激光沉積技術(shù), 300納米厚的羥基磷灰石薄膜沉積在它的表面, 其中幾乎沒有細(xì)胞粘附. 細(xì)胞培養(yǎng)法用于研究羥基磷灰石沉積在PVA-H上后鼠纖維細(xì)胞之間的粘附的效果. 用非晶磷灰石膜包覆的水分含量33%PVA-H的細(xì)胞粘附最高可達(dá)采用常用的組織培養(yǎng)皿的水平. 這項(xiàng)技術(shù)還有效地改善細(xì)胞的附著力,即使在含水量較高(53%)的PVA-H. 這是一個(gè)嶄新的技術(shù),以改善附著PVA-H的基本骨和天然軟骨之間的生物相容性.
主題詞: 水凝膠; 細(xì)胞黏附力; 磷灰石; 薄膜; 激光處理; 生物材料
1. 簡(jiǎn)介
在許多關(guān)節(jié)疾病如股骨頭缺血性股骨頭壞死中, 該病局限于一個(gè)病變的關(guān)節(jié)軟骨，單純手術(shù)切除周圍組織將足以彌補(bǔ). 但是,目前的治療做法往往利用人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù), 其中良性骨組成一個(gè)龐大的聯(lián)合也刪掉了. 要解決這個(gè)問題使病變只限于關(guān)節(jié)面, 我們研制人造軟骨制成的PVA-H,一種高水含量的高分子材料。PVA-H顯示幾乎沒有蛋白質(zhì)吸附,不寄生在生物活組織界面. 這些都是關(guān)節(jié)面人造軟骨非常重要的特點(diǎn)，原因是吸附的任何蛋白會(huì)抑制潤(rùn)滑轉(zhuǎn)嫁PVA-H關(guān)節(jié)面從而損害潤(rùn)滑功能. 不過相反地, 安裝人工軟骨組織需要在PVA-H和周圍組織以及軟骨的界面有強(qiáng)有力的粘附。
本文提出了一種方法,將帶來更好的粘附只是在PVA-H表面的某些區(qū)域. 即薄膜磷灰石(磷灰石)則用來沉積在與周圍組織接觸的區(qū)域而不是相應(yīng)的PVA-H關(guān)節(jié)面上. 為了用磷灰石沉積在PVA-H的指定地區(qū)，利用候補(bǔ)浸水過程或仿生過程的方法不能適用; 因?yàn)檫@些化學(xué)方法需要在解決過程中浸透整個(gè)PVA-H標(biāo)本. 通常用于金屬植入物磷灰石涂層的等離子噴涂技術(shù)是一種方法，在這種方法中的磷灰石在高溫下溶化然后噴灑; 這種方法對(duì)PVA-H來說是不適用,因?yàn)檫@些都是低熔點(diǎn)材料.
因此,我們嘗試采用激光脈沖沉積(PLD)技術(shù),允許非熱，薄膜沉積的磷灰石基體,以及選擇性涂層基板面有一個(gè)理想的形狀, 而其中原料的化學(xué)成分和薄膜基本上是一致的 。我們先前的證據(jù)證明，高晶磷灰石膜可以在PLD薄膜的形成和樣品的隨后退火中得到。由于PVA-H不能被加熱到退火溫度，在目前的研究中,我們?cè)噲D利用非晶磷灰石薄膜(HAam). 研究是否HAam沉積提高PVA-H表面的生物相容性或細(xì)胞粘附，對(duì)通常用于細(xì)胞粘附的鼠纖維進(jìn)行試驗(yàn)養(yǎng)殖.
2. 實(shí)驗(yàn)
2.1. PVA-H的準(zhǔn)備
用在實(shí)驗(yàn)中的PVA-H由一種低溫冷結(jié)晶法產(chǎn)生. 具有1700聚合度的聚(乙烯醇)粉溶于二甲基亞砜溶劑, 倒入一個(gè)長(zhǎng)方形模子,在-20℃結(jié)晶. 然后這種材料浸在酒精以消除PVA膠體中的DMSO。之后對(duì)PVA-H進(jìn)行130攝氏度真空中的24小時(shí)熱處理.然后材料被浸于蒸餾水48小時(shí)，比較水化前后的重量進(jìn)行含水量計(jì)算.
在試驗(yàn)中采用的水合狀態(tài)的PVA-H的尺寸是15.6毫米,直徑1.5毫米厚. 為了調(diào)查細(xì)胞粘附中含水量的影響,對(duì)24張低含水量PVA-H (wc33, 含水量33%)及高含水量PVA-H (wc53,含水量53%)分別編寫.
2.2. 磷灰石沉積
用通用PLD技術(shù)和表1所示大部分參數(shù),計(jì)量的磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2——seikagaku公司,日本)沉積到12張wc33和wc53樣本的表面，形成一個(gè)約為300nm的厚度. 在PVA-H表面，HAam薄膜的X光衍射圖案證實(shí)該薄膜是非晶態(tài).
2.3. 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)程序
這些PVA-H樣品被用作培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠纖維細(xì)胞; 在L929小鼠纖維中產(chǎn)生肉瘤細(xì)胞系(NCTC 克隆 929; 奚住友制藥公司,日本). 鍍PVA-H媒介的HAam以下簡(jiǎn)稱為wc33+HAam和wc53+HAam,而沒有鍍PVA-H的HAam簡(jiǎn)稱為wc33non和wc53non.
在以前的實(shí)驗(yàn)中, PVA-H樣品用環(huán)氧乙烷氣體滅菌. 一種常用的組織培養(yǎng)器皿(中藥,朝日玻璃技術(shù)公司,日本)也被用于控制組. 培養(yǎng)液中使用的是鷹 附加10%的牛胎牛血清. 纖維細(xì)胞中的一萬個(gè)細(xì)胞接種于PVA-H培養(yǎng)基， 培養(yǎng)分別保持在攝氏37度的孵化器中，用5%二氧化碳維持，保持99%的相對(duì)濕度. 每次培養(yǎng)條件下的實(shí)驗(yàn)次數(shù)定為n=3， 該細(xì)胞從開始后的24,78, 120和168小時(shí)后用0.25%胰蛋白從媒介中剝離. 錐蟲藍(lán)被添加到懸浮細(xì)胞中，其中含有被剝離的細(xì)胞以挑選出死亡的,而活細(xì)胞數(shù)量用血米來計(jì)算.
3. 結(jié)果與討論
圖 1列出了wc33+haam樣本表面掃描電子顯微鏡圖像. 在磷灰石沉積過程中,圖的左側(cè)部分用鋁箔覆蓋以防止HAam沉積. 能量色散X-射線光譜的線分析是沿圖. 1中的白線.射線的強(qiáng)度正如圖1所獲得的那樣; 在這里,鈣描繪了HAam區(qū)域. 這些數(shù)字表明，在PVA-H上HAam薄膜通過PLD是可形成的，同時(shí)選擇性沉積的表面積也是可能的.
圖 2表明了細(xì)胞在wc33和wc53樣本中培養(yǎng)120小時(shí)后的實(shí)例. 圖 2(一)顯示了wc33對(duì)照組,其中幾乎所有的細(xì)胞是梭形的, 顯示其粘附于培養(yǎng)基. 在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中,對(duì)照組的情況是典型的最佳狀態(tài)的細(xì)胞, 評(píng)價(jià)是基于實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組狀態(tài)的相似程度.
圖 2(b)展示的是wc33+Haam組. 球形細(xì)胞分散在梭形細(xì)胞中; 表明一些細(xì)胞剝離培養(yǎng)基飄散到培養(yǎng)液之中. 圖2(c)展示wc33non組. 因?yàn)榭梢钥闯鲇性S多球形細(xì)胞,wc33non組表現(xiàn)出不佳的細(xì)胞粘附. 在圖 2(e)和(F)， 在wc53+HAam和wc53non組的顯微照片中分別可以看出幾個(gè)典型的紡錘狀細(xì)胞,它們細(xì)胞粘附較弱于wc33non組(圖(c)).
圖 3顯示細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以量化圖 2的結(jié)果. 圖 3(a)說明孵育時(shí)間和wc33樣本的細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系. 細(xì)胞數(shù)隨著所用的時(shí)間成倍增加.在wc33non組中，細(xì)胞數(shù)在168小時(shí)后為最高，其次是wc33+haam組和對(duì)照組,按順序如此下去. 經(jīng)過168小時(shí)培養(yǎng)，觀察到對(duì)照組與wc33+HAam組的細(xì)胞數(shù)無顯著差異(t-檢驗(yàn), p=0.107).
從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線中也可以計(jì)算出細(xì)胞數(shù)的倍增時(shí)間(DT). L929細(xì)胞的DT通常在20至25小時(shí); 在這種情況下, wc33non小組的DT是32小時(shí), wc33+HAam組為26小時(shí)，對(duì)照組為25h。
圖 3(b)展示在wc53樣本中L929的擴(kuò)散. 相較于圖 3(一),細(xì)胞的增殖隨著PVA-H含水量增多而明顯下降. wc53non組的DT為49h, wc53+haam組為31h，對(duì)照組為26h. 盡管含水量高,不過通過分別對(duì)wc53non和wc53+HAam組比較細(xì)胞數(shù)和DT之后，磷灰石沉積的效果是很明顯的.
如上所述, 為了取得更好的與周圍組織和將PVA-h用作表面置換的材料附著力, 除關(guān)節(jié)面外所有PVA-h表面應(yīng)包覆磷灰石. 但在實(shí)踐中, 用化學(xué)改性的方法如交替浸泡實(shí)現(xiàn)PVA-H表面特意覆蓋磷灰石涂層是不可能.結(jié)構(gòu)水交換也可以發(fā)生在PVA-H上, 用化學(xué)改性的方法在溶液中浸泡所做的那樣, 溶液滲透到PVA-H.
PVA-H的優(yōu)勢(shì)是它的機(jī)械性能,如彈性模量可通過改變水的含量來控制。因此, 從保留PVA-h的力學(xué)性能的角度來看，化學(xué)改性的方法是不實(shí)際. 在另一方面, PLD技術(shù)可使磷灰石涂層剛剛選定PVA-H曲面,而 對(duì)PVA-H本身材料的性能并無影響.
這是人所共知的,細(xì)胞粘附差的一般性能是由于一個(gè)高度的親水媒體使細(xì)胞粘附變得不可能. 在實(shí)驗(yàn)中, 細(xì)胞增殖率(CPR)的計(jì)算是168小時(shí)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)除以對(duì)照組的細(xì)胞數(shù); 更小的的實(shí)用價(jià)值顯示較弱的細(xì)胞粘附. wc33non和wc53non組的細(xì)胞增殖率分別為0.43和0.11; 顯示了極差細(xì)胞粘附. 但是,wc33+haam組的細(xì)胞增殖率為0.83, DL也幾乎和對(duì)照組相同,著顯示了被haam涂料成功覆蓋的PVA-H使粘附能力幾乎與控制組相等. 具體來說, 被HAam沉積的PVA-H擁有近一倍細(xì)胞粘附能力. 相比之下, wc53+HAam組的細(xì)胞增殖率為0.41,相當(dāng)于大約wc33+Haam組一半的細(xì)胞粘附. 盡管如此,這個(gè)值仍相當(dāng)于wc53non組的細(xì)胞增殖率0.11的 3.7倍，即使在wc53樣本的HAam涂料中也展現(xiàn)了相當(dāng)?shù)男Ч?
4. 結(jié)論
通過PLD技術(shù)使HAam薄膜沉積在PVA-H表面大大改善了原來PVA-H較弱的細(xì)胞粘附. HAam薄膜沉積可以選擇性地適用在PVA-H表面的特定區(qū)域上，這是把PVA-H作為人工關(guān)節(jié)天然骨及軟骨的一種非常有效的手段.
鳴謝
感謝Tomoyo Gotoh 和Takako Osawa為我們提供技術(shù)援助. 這項(xiàng)工作得到了來自日本教育,文化,體育,科技等部門的資助 (編號(hào)16500308,2004年).