動物細胞基因組DNASNP的生物芯片檢測.doc

《動物細胞基因組DNASNP的生物芯片檢測.doc》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《動物細胞基因組DNASNP的生物芯片檢測.doc（12頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

動物細胞基因組DNA SNP的生物芯片檢測 來源：易生物實驗 瀏覽次數(shù)：2082 網(wǎng)友評論 0 條 單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在群體中的發(fā)生頻率不小于1%。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，目前已發(fā)現(xiàn)約400萬個SNP遺傳標記。 關(guān)鍵詞：動物細胞基因組DNASNP生物芯片單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism 實驗原理： 1、SNP的概念及意義 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在群體中的發(fā)生頻率不小于1%。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，目前已發(fā)現(xiàn)約400萬個SNP遺傳標記。 SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換（transition）[指同型堿基之間的轉(zhuǎn)換，如嘌呤與嘌呤( G-A) 、嘧啶與嘧啶( T-C) 間的替換]或顛換（transversion）[指發(fā)生在嘌呤與嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T) 之間的替換]所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個或4個等位多態(tài)性，但實際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。 SNP變異可能是轉(zhuǎn)換（C→T，在其互補鏈上則為G→A），也可能是顛換（C→A，G→T，C→G，A→T）。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。轉(zhuǎn)換已C→T為主（圖27-1），其原因是CpG的C是甲基化的，容易自發(fā)脫氨基形成胸腺嘧啶T，CpG 也因此變?yōu)橥蛔儫狳c。 圖27-1 根據(jù)人類基因組的研究資料，DNA的核苷酸序列在不同個體中至少有99.9％是相同的；但在任意選定的兩個個體中，DNA序列可以有數(shù)以百萬計的變異點，其中絕大多數(shù)都屬于SNP。SNP是人類基因組DNA序列中最常見的變異形式。據(jù)估計，發(fā)生在基因的蛋白質(zhì)編 碼區(qū)的約4萬個SNP，可以導致蛋白質(zhì)合成時氨基酸的“錯義”改變?，F(xiàn)已知，至少93％的人類基因都存在SNP。人類基因組SNP研究所揭示的人種、人群和個體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對疾病的診斷、治療和預(yù)防帶來革命性的變化。 SNP被稱為“第三代DNA遺傳標記”。這種遺傳標記的特點是單個堿基的置換，與第一代的RFLP及第二代的STR以長度的差異作為遺傳標記的特點截然不同。SNP的分布密集，在人類基因組中被認為有300萬個以上的SNP遺傳標記，這可能達到了人類基因組多態(tài)位點數(shù)目的極限，因此被認為是應(yīng)用前景最好的遺傳標記物。 2、SNP檢測方法 傳統(tǒng)的SNP檢測方法是采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性梯度凝膠電泳分析（DGGE），溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)、等位基因特異聚合酶鏈反應(yīng)分析（AS-PCR）等。但這些必須通過凝膠電泳進行檢測，因此，距快速、高效、自動化的目標還相差甚遠。傳統(tǒng)的RFLP只能檢測到SNP的一部分，測序技術(shù)既費時費力，又不易實現(xiàn)自動化，不適宜于SNP的檢測；SSCP則很難滿足自動化的需要，難以大規(guī)模開展工作。因此，這些方法均未被廣泛采用。目前已有多種新興的方法可用于SNP檢測，如變性的高效液相色譜檢測(DHPLC)、等位基因特異性延伸（allele-specific primer extension，ASPE）、單堿基延伸（single base extension，SBE）技術(shù)、DNA列陣微測序法、動態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接（OLA）、TaqMan探針技術(shù)、分子信標（molecular beacons）技術(shù)、Minisequencing、DNA芯片等。其中基因芯片技術(shù)具有高通量、簡便快捷、平行化和成本低廉等優(yōu)點，且芯片技術(shù)的高密度探針矩陣可為大規(guī)模SNP分型提供一個高效檢測途徑。芯片技術(shù)平臺包括微球微點陣，纖維薄膜微點、玻璃片基微點陣芯片等，其探針密度跨越范圍幾百至上百萬不等，其中GoldenGateTM所使用的微球芯片密度可達100萬，Affymetrix SNP芯片密度近200萬。 DNA芯片技術(shù)是近年來新開發(fā)的一種DNA序列變異檢測工具。DNA芯片(DNA chip)，也稱生物芯片(biochip)，其大小與計算機上的CPU芯片相似，約1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作為載體基片，芯片上鋪了一層肉眼看不見的DNA纖維“地毯”，即具有特定堿基序列的探針。待測基因經(jīng)提取后，被切成長短不一的片段，經(jīng)熒光化學物質(zhì)標記后，注射到嵌有芯片的載片上。由于DNA和探針雜交的程度與熒光強度相關(guān)，因此通過激光掃描，即可根據(jù)熒光強弱測出被檢測序列的變異。 目前，基于DNA芯片的SNP檢測平臺以及功能成為高通量、大規(guī)模、全基因組SNP檢測分析的主流技術(shù)。其中典型的代表是Affymetrix公司的SNP檢測高密度DNA微陣列芯片。此外，還有Illumina公司的SNP檢測芯片，如Beadlab平臺，是Illumina公司整合GoldenGate多通道位點特異性延伸擴增檢測方案和BeadArray高密度微陣列技術(shù)，開發(fā)而成的頂級高通量SNP基因分型系統(tǒng)，每天可完成超過44萬個基因分型。 新的Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0（圖27-2）產(chǎn)品的特點是超過1,800,000個遺傳變異標志物，包括超過906,600個SNP和超過946,000個用于檢測拷貝數(shù)變化的探針。大約有482,000個SNPs來自于前代產(chǎn)品500K和SNP5.0芯片。剩下424,000s個SNP包括了來源于國際HapMap計劃中的標簽SNPs，X，Y染色體和線粒體上更具代表性的SNPs，以及來自于重組熱點區(qū)域和500K芯片設(shè)計完成后新加入dbSNP數(shù)據(jù)庫的SNPs。SNP6.0還包括了202,000個用于檢測5,677個已知拷貝數(shù)變異區(qū)域的探針，這些區(qū)域來源的于多倫多基因組變異體數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫中的每個3,182個非重疊片斷區(qū)域分別平均用61個探針來檢測。除了檢測這些已知的拷貝數(shù)多態(tài)區(qū)域，還有超過744,000個探針平均分配到整個基因組上，用來發(fā)現(xiàn)求知的拷貝數(shù)變異區(qū)域。設(shè)計方面SNP 6.0芯片只取最佳SNP位點和每組等到位基因的一個完全匹配，并有三次重復檢測，所以總共只有六個探針（表22-1）。 圖27-2 Affymetrix公司的SNP6.0芯片 圖27-3反映了運用Affymetrix公司的SNP6.0芯片完成全基因組SNP檢測的技術(shù)流程。 圖27-3 Overview of the Genome-Wide Human SNP Assay Kit 5.0/6.0. Briefly, total genomic DNA (500 ng) is digested with Nsp I and Sty I restriction enzymes and ligated to adaptors that recognize the cohesive 4 bp overhangs. All fragments resulting from restriction enzyme digestion, regardless of size, are substrates for adaptor ligation. A generic primer that recognizes the adaptor sequence is used to amplify adaptor-ligated DNA fragments. PCR conditions have been optimized to preferentially amplify fragments in the 200 to 1,100 bp size range. PCR amplification products for each restriction enzyme digest are combined and purified using polystyrene beads. The amplified DNA is then fragmented, labeled and hybridized to the array. 3、微點樣法制備SNP檢測DNA微陣列芯片 微點樣法是制備DNA微陣列芯片的主要方法之一。該方法將事先設(shè)計并合成好的DNA探針通過點樣儀（arrayer）按照一定的排列方式微量針點或噴點固定到固體基底表面，制備成DNA微陣列芯片（圖27-4）。在芯片的制備過程中，基底材料的選擇及其表面的化學修飾是至關(guān)重要的。許多材料都可以用作生物芯片的基底材料，如濾膜、玻璃片以及水凝膠膜。 圖27-4 一種點樣儀（arrayer），嵌入圖為點樣針 3.1、載玻片及其氨基硅烷化修飾 由于玻片容易獲得，具有本地熒光低、透明度高、熱學性質(zhì)好、硬度高、易于在表面進行化學修飾以固定核酸探針等特點，從而使之成為一種目前最為常用的生物芯片基底材料之一。此外載玻片表面光滑，而且沒有多孔結(jié)構(gòu)，標記的靶序列可以直接與固定探針結(jié)合，而不會受擴散效應(yīng)的影響，具有較高的局部濃度和較快的雜交反應(yīng)速度。這種沒有多孔結(jié)構(gòu)的表面也非常適合洗脫多于探針和非特異性吸附的標記靶標序列。大多數(shù)商品化的用于制備生物芯片的載玻片已經(jīng)經(jīng)過多聚賴氨酸、氨基硅烷或氨基修飾（圖27-5）。盡管光滑無孔的載玻片在生物芯片應(yīng)用中具有很多優(yōu)點，但是這種載玻片在固定結(jié)構(gòu)化生物分子，如抗體分子或結(jié)構(gòu)化的寡核苷酸探針分子時很難保持其固有的分子結(jié)構(gòu)；而且這種載玻片表面的固定能力有限，影響了檢測靈敏度。 載玻片的氨基硅烷化及DNA固定原理如圖27-5所示。氨基修飾氨基硅烷化基底需要使可逆的希夫堿（Schiffs base）還原成穩(wěn)定的烷胺鍵化合物，圖27-6為硼氫化鈉還原步驟示意圖。 3.2、載玻片上涂覆的水凝膠或聚合物膜： 為了解決平滑無孔載玻片的缺陷，將一種功能化的三維親水多孔凝膠（如聚丙烯酰氨凝膠塊）鋪在載玻片表面，作為固定DNA分子的基底材料（圖27-7）。多孔水凝膠材料結(jié)合 了平滑載玻片反應(yīng)速度快和孔狀材料可提供類似于液相的環(huán)境及較大的固定能力等優(yōu)點。在這種基底上進行的雜交反應(yīng)更接近于均一液相環(huán)境中的反應(yīng)而不是固液界面的反應(yīng)。而且這類多孔凝膠膜可在通用商品化的精密度較高的芯片點樣儀和掃描儀上使用。這類水凝膠膜的缺陷是具有較高的熒光背景，反應(yīng)完后需要經(jīng)過長時間的清洗，才能除去表面非特異吸附的標記靶標；其次，在于液體接觸時遇到較高雜交溫度很容易破碎甚至溶解；最后，它的制備過程比較復雜，商品化的基片價格昂貴。 瓊脂糖中鄰近的羥基可在較為溫和的條件下被高碘酸鈉氧化，生成醛基。醛基可以與修飾了氨基的DNA分子探針反應(yīng)形成希夫堿（圖27-7）。 圖27-5 氨基硅烷化玻片的表面處理及氨基修飾的DNA探針的固定。 醛基可以與修飾了氨基的DNA分子探針反應(yīng)形成希夫堿（Schiffs base）。 圖27-6 硼氫化鈉還原希夫堿形成烷胺鍵化合物步驟示意圖 3.3、寡核苷酸DNA微陣列芯片檢測SNP技術(shù)： 寡核苷酸芯片檢測基因突變技術(shù)是基因芯片技術(shù)的一種。該技術(shù)用于檢測基因突變的基本原理是在玻璃、硅等載體上，根據(jù)檢測需要，設(shè)計、固定多個特異的寡核苷酸探針。而后將大量經(jīng)擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標記分子的待測DNA樣品與之雜交，若兩者存在至少一個堿基的差異時，即可產(chǎn)生雜交結(jié)果即熒光信號值的差異。以此來判斷待測樣品與芯 片上的哪一個探針完全配對，即可得出待測樣品特定位點的堿基序列，從而判斷是否存在突變及突變位點和類型。該法具有準確、快速、高效和高通量地分析生物基因信息的優(yōu)點。 圖27-7 瓊脂糖膜的高碘酸鈉活化及氨基修飾的DNA分子探針的固定 圖27-8 p53基因突變的寡核苷酸DNA微陣列芯片檢測（PNAS 1999,96:7382-7387） 人類p53位于1713，全長16~20，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子，分為野生型、突變型及介于兩者之間的雜合狀態(tài)等3種類型。最常見的p53突變?yōu)辄c突變，而點突變最常見的是單個堿基替換。p53結(jié)構(gòu)上有5個進化上的高度保守區(qū)，多數(shù)p53基因突變是發(fā)生在這些保守區(qū)內(nèi)的5~8外顯子上。p53基因突變是人類多種惡性腫瘤最常見的基因改變，約有50%以上的腫瘤患者發(fā)現(xiàn)有p53突變。因此檢測p53基因突變對于確定腫瘤的病因!判斷預(yù)后以及治療方案的制定具有十分重要的意義。 p53基因突變的寡核苷酸DNA微陣列芯片檢測如圖27-8示意。陣列上的DNA探針5個一組。 每個探針除一個位點錯配外，其他堿基與參考序列互補，稱為“置換”位置。在“置換”位置，包括四種可能的核苷酸(A、C、G、T) 和一個堿基的缺失。雜交條件優(yōu)化后，熒光標記的待測DNA只與其序列最匹配的探針雜交，取得相對與組內(nèi)其他四種探針更高的熒光信號。Affymetrix公司p53基因突變檢測寡核苷酸微陣列芯片包含針對p53基因每個堿基的探針組（5個探針/堿基）。圖27-9 顯示了熒光標記的p53基因外顯子PCR擴增產(chǎn)物與p53基因突變檢測寡核苷酸微陣列雜交后的熒光圖象。 示例圖片： 圖27-9 熒光標記的p53基因外顯子PCR擴增產(chǎn)物與p53基因突變檢測寡核苷酸微陣列雜交后的熒光圖象（Nucl. Acids Res. 2005, 33: e90） 圖27-10 The genomic SNP detection assay. Human genomic DNA is hybridized to microarray- immobilized capture oligonucleotides harboring a single-nucleotide variation. After removing unbound gDNA, oligonucleotide-modified gold nanoparticles hybridize to the captured target nucleic acid. Following a wash step, signal amplification is performed. During this step, elementary silver is deposited on the gold nanoparticles, greatly enhancing their light-scattering ability. (From: http://www.devicelink.com/ivdt/archive) 點此下載全文：動物細胞基因組DNA SNP的生物芯片檢測.pdf