流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟.doc

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流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期操作步驟 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，按1×106 cells/ mL以1mL接種于100mm培養(yǎng)皿內(nèi) ↓ 24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加藥,照射） ↓ 特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn) ↓ 收集原培養(yǎng)液，洗后的PBS和消化后的細(xì)胞，將三者混勻放入15ml離心管中 ↓ 1000rpm離心5min（短時(shí)低速離心） ↓ 棄上清，用1.5ml預(yù)冷PBS，1000rpm離心5min后去除PBS和細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞碎片 ↓ 加入1.5ml預(yù)冷PBS,在渦旋狀態(tài)下加入3.5ml無(wú)水乙醇，混勻后，于4℃固定30min,或-20℃長(zhǎng)期保存。 ↓ 1000r/min,離心5min ↓ 將乙醇吸除，加PBS清洗混勻 ↓ 1000r/min,5min再離心一遍，將殘留在細(xì)胞上的乙醇除去 ↓ 吸除離心管內(nèi)PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室溫下避光染色30min ↓ 將離心管內(nèi)的細(xì)胞過(guò)濾(300um尼龍網(wǎng)膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)），標(biāo)記EP管 ↓ 提前一天網(wǎng)上預(yù)約 ↓ 開(kāi)機(jī)（先開(kāi)儀器后開(kāi)軟件） ↓ 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般分為5部分：①流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；② 激光光源及光束成形系統(tǒng)；③ 光學(xué)系統(tǒng)；④ 信號(hào)檢測(cè)、存貯、顯示、分析系統(tǒng)；⑤ 細(xì)胞分選系統(tǒng)。 ↓ 檢測(cè)前先渦旋使細(xì)胞混勻懸浮呈單個(gè)細(xì)胞，然后插入流式細(xì)胞儀上 ↓ 流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱 ↓ 液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光（488nm激發(fā)光源） ↓ 熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析（熒光染料和細(xì)胞DNA分子特異性結(jié)合，可以檢測(cè)出細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比例） ↓ 在用第三方軟件分析之前，將流式結(jié)果按如下所示導(dǎo)出 結(jié)果分析——Modfit軟件分析 圖片拷貝：直接Ctrl+C ——Flowjo軟件分析 FCM-DNA 量分析 1 個(gè)細(xì)胞增殖群時(shí)，可將DNA 含量分布組方圖分為三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1和G2M 細(xì)胞峰的 DNA 分布均為正態(tài)分布，S 期可以認(rèn)為是一個(gè)加寬的正態(tài)分布 ↓ 檢測(cè)結(jié)果刻錄光盤(pán)保存 ↓ 關(guān)機(jī)（先關(guān)軟件后關(guān)儀器，關(guān)機(jī)前需清洗） 正常細(xì)胞DNA含量：2n-4n 凋亡細(xì)胞：核內(nèi)DNA斷裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DNA含量減少。PI染色后，熒光強(qiáng)度減小而形成一個(gè)DNA含量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）。 1、縱坐標(biāo)Cell Number：即計(jì)數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)； 2、橫坐標(biāo)DNA Content：即DNA含量； 3、G1、G2、S三期在圖中已經(jīng)標(biāo)示； 4、右側(cè)數(shù)字含義：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值為55.56；53.84%即G1期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值為107.72，5.64%即G2期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的5.64%； Annexin V-EGFP/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 基本原理： 磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素Ⅴ（AnnexinⅤ）發(fā)生特異結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過(guò)正常細(xì)胞膜，只能進(jìn)入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，熒光強(qiáng)度與PI結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系。 正常細(xì)胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ- 凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn)——PI-/AnnexinⅤ+ 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+ 壞死細(xì)胞：膜嚴(yán)重破損，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+ 幾乎不存在膜結(jié)構(gòu)——PI+/AnnexinⅤ- 實(shí)驗(yàn)步驟： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×106 cells/ mL以1mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi) ↓ 24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加入藥物） ↓ 特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn) ↓ 細(xì)胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，以防引起假陽(yáng)性） ↓ 加入PBS制成細(xì)胞懸液（移液槍吹打6-8次） ↓ 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)（單個(gè)分離懸?。? ↓ 將細(xì)胞懸液移入15ml離心管中 ↓ 2000rpm離心5min,PBS吸除 ↓ 用PBS 清洗細(xì)胞2次（2000rpm，離心5min收集細(xì)胞） ↓ 用400ul 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞(濃度大約為1×106 cells/ml) ↓ 在細(xì)胞懸液中加入5ul Annexin V-EGFP，輕輕混勻后于2-8℃避光條件下孵育15 min ↓ 加入10ul PI 后輕輕混勻,于2-8℃避光條件下孵育5 min ↓ 在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè) 流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)采用Ex.= 488nm雙波長(zhǎng)激發(fā)，Em.= 510 nm檢測(cè)EGFP熒光(FL1 channel)和>575 nm的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)PI。細(xì)胞應(yīng)可分成三個(gè)亞群：活細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，壞死細(xì)胞（包括極晚期凋亡細(xì)胞）有綠色和紅色熒光雙重染色。 在流式細(xì)胞術(shù)雙參數(shù)散點(diǎn)圖上左下象限顯示活細(xì)胞，為（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為Annexin V +/PI+；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)Annexin V +/PI-。