固定化酶與固定化細(xì)胞

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1、第 四 章 固 定 化 酶 與 固 定 化 細(xì) 胞 本 章 內(nèi) 容o 酶 的 固 定 化 (1)為 什 么 要 固 定 化 ? (2)怎 樣 固 定 化 ?(固 定 化 方 法 ) (3) 固 定 化 酶 的 特 性o 細(xì) 胞 的 固 定 化 (1)細(xì) 胞 固 定 化 所 用 的 方 法 (2) 固 定 化 細(xì) 胞 的 特 性o 輔 酶 的 固 定 化 什 么 是 固 定 化 酶 ？o 指 固 定 在 一 定 載 體 上 并 在 一 定 空 間 范 圍 內(nèi) 進(jìn)行 催 化 反 應(yīng) 的 酶 。一 酶 的 固 定 化 直 接 利 用 微 生 物 酶 （ 1） 不 穩(wěn) 定 。 在 高 溫 、 高 壓

2、、 強(qiáng) 酸 、 強(qiáng) 堿 下 。（ 2） 易 失 活 。 即 使 在 最 適 合 的 條 件 下 反 應(yīng) 。（ 3） 回 收 困 難 。 用 適 當(dāng) 方 法 提 取 目 的 產(chǎn) 物 后 ， 殘 存 酶 回 收 困 難 。（ 4） 反 應(yīng) 速 度 減 慢 。 不 容 易 和 毒 副 分 子 和 產(chǎn) 物 分 離 .（ 5） 經(jīng) 濟(jì) 上 不 合 算 。 一 次 性 反 應(yīng) 后 不 能 再 次 使 用 。阻 礙 了 微 生 物 酶 的 應(yīng) 用 和 發(fā) 展 。研 制 固 定 化 酶 和 固 定 化 菌 體(一 )為 什 么 要 固 定 化 ? (一 )為 什 么 要 固 定 化 ?o 在 一 定 程 度

3、上 可 以 改 善 酶 的 穩(wěn) 定 性 ；o 可 以 多 次 反 復(fù) 使 用 ， 有 利 于 采 用 連 續(xù) 操 作 工藝 ， 從 而 使 酶 和 細(xì) 胞 的 使 用 率 提 高 ， 降 低 生產(chǎn) 成 本 ；o 酶 和 細(xì) 胞 不 混 入 產(chǎn) 物 ， 可 精 簡(jiǎn) 產(chǎn) 物 分 離 工 序 。 (1)固 定 化 在 一 定 程 度 上 可 以 改 善 酶 的 穩(wěn)定 性o 固 定 化 增 加 了 酶 的 耐熱 性 （ 熱 變 性 原 理 ）o 固 定 化 增 加 了 酶 對(duì) 蛋白 變 性 劑 （ 尿 素 ， 鹽酸 胍 ） 等 的 抵 抗 能 力o 固 定 化 減 少 了 蛋 白 酶的 作 用 （ 阻

4、 礙 了 活 性部 位 的 接 近 ） (2)固 定 化 使 酶 和 細(xì) 胞 的 使 用 率 提 高o 江 南 大 學(xué) 的 孫 志 浩 通 過(guò) 卡拉 膠 包 埋 的 方 法 ， 使 酶 的重 復(fù) 利 用 30個(gè) 批 次 后 活 性沒(méi) 有 明 顯 減 少 ， 大 大 促 進(jìn)了 酶 的 利 用 率 ， 加 速 了 工藝 工 業(yè) 化 進(jìn) 程 (3)可 精 簡(jiǎn) 產(chǎn) 物 分 離 工 序底 物 和 產(chǎn) 物 更 容易 和 酶 分 離 (二 ) 怎 樣 固 定 化 ?(固 定 化 方 法 ) 固 定 化 的 第 五 種 方 法 變 性 法o 在 不 使 用 載 體 的 情 況 下 ， 借 助 加 熱 、 冰

5、凍 或-射 線 等 物 理 手 段 ， 也 可 通 過(guò) 添 加 檸 檬 酸 、各 種 絮 凝 劑 、 交 聯(lián) 劑 或 變 性 劑 處 理 ， 使 細(xì) 胞內(nèi) 起 破 壞 作 用 的 蛋 白 酶 變 性 、 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 固 定和 菌 體 聚 集 成 大 顆 粒 達(dá) 到 固 定 化 的 目 的 。 此法 制 備 的 細(xì) 胞 一 般 只 用 于 完 成 單 酶 或 少 數(shù) 幾種 酶 催 化 反 應(yīng) 。 (1) 吸 附 法o 物 理 吸 附 是 通 過(guò) 氫 鍵 、 疏 水 鍵 和 電 子 親 和 力等 物 理 作 用 力 將 酶 固 定 于 不 溶 性 載 體 的 方 法 。常 用 的 載 體 有

6、高 嶺 土 、 皂 土 、 硅 膠 、 磷 酸 鈣膠 、 氧 化 鋁 、 微 孔 玻 璃 等 無(wú) 機(jī) 吸 附 劑 o 離 子 交 換 吸 附 是 在 適 宜 的 pH和 離 子 強(qiáng) 度 條 件下 ， 利 用 酶 的 側(cè) 鏈 解 離 基 團(tuán) 和 離 子 交 換 劑 的相 互 作 用 而 達(dá) 到 固 定 化 的 一 種 方 法 。 最 常 用的 交 換 劑 有 CM 纖 維 素 、 DEAE 纖 維 素 、DEAE 葡 聚 糖 凝 膠 等 。 o 蛋 白 質(zhì) 濃 度 ： 若 吸 附 劑 的 量 固 定 ， 隨 蛋 白 質(zhì) 濃 度 增 加 ， 吸 附量 也 增 加 ， 直 至 飽 和 。o pH ：

7、 影 響 載 體 和 酶 的 電 荷 變 化 ,從 而 影 響 酶 吸 附 。o 離 子 強(qiáng) 度 ： 多 方 面 的 影 響 ， 一 般 認(rèn) 為 鹽 阻 止 吸 附 。o 溫 度 ： 蛋 白 質(zhì) 往 往 是 隨 溫 度 上 升 而 減 少 吸 附 。o 載 體 ： 蛋 白 質(zhì) 在 固 體 載 體 上 的 吸 附 速 度 要 比 小 分 子 慢 得 同 時(shí) 對(duì) 于 非 多 孔 性 載 體 ， 則 顆 粒 越 小 吸 附 力 越 強(qiáng) 。 多 孔 性 載體 ， 要 考 慮 吸 附 對(duì) 象 的 大 小 和 總 吸 附 面 積 的 大 小 。 影 響 酶 蛋 白 在 載 體 上 吸 附 程 度 的 因

8、素 吸 附 法 特 點(diǎn)o 優(yōu) 點(diǎn) ： 操 作 簡(jiǎn) 便 ， 處 理 條 件 溫 和 ， 酶 的 高 級(jí)結(jié) 構(gòu) 和 活 性 中 心 不 易 破 壞 ， 有 利 于 制 備 高 活性 酶o 缺 點(diǎn) ： 載 體 與 酶 的 結(jié) 合 力 較 弱 ， 在 高 離 子 強(qiáng)度 下 酶 易 從 載 體 上 脫 落 吸 附 法 （ 制 備 的 工 藝 ）o 水 相 固 定 化 法 這 是 最 常 見(jiàn) 的 吸 附 固 定 化 方 法 ， 即將 酶 溶 解 于 緩 沖 液 中 ， 加 入 載 體 ， 振 蕩 或 攪 拌 一 定時(shí) 間 后 ， 抽 濾 、 洗 滌 、 冷 凍 干 燥 即 可 得 固 定 化 酶 o 載

9、體 表 面 涂 布 法 將 酶 溶 入 少 量 緩 沖 液 中 ， 加 入 載體 ， 混 合 均 勻 ， 冷 凍 干 燥 可 得 固 定 化 酶 。 此 法 相 當(dāng)于 直 接 將 酶 涂 布 于 載 體 上 ， 避 免 了 水 相 固 定 化 中 酶的 大 量 流 失o 溶 劑 沉 淀 法 即 在 低 溫 下 向 含 有 載 體 的 脂 肪 酶 液 中加 入 酶 的 有 機(jī) 溶 劑 作 沉 淀 劑 (如 丙 酮 )使 酶 析 出 ， 沉淀 在 載 體 表 面 。 此 法 所 得 固 定 化 酶 酶 活 性 較 高 ， 載體 性 質(zhì) 對(duì) 固 定 化 無(wú) 明 顯 影 響 ， 但 酶 在 載 體 表

10、 面 分 布不 均 勻 吸 附 法 （ 制 備 的 工 藝 ）o 游 離 固 定 化 法 將 具 有 一 定 親 水 性 的 載 體 分 散 于 疏 水 溶 劑 中 ，另 將 酶 粉 溶 入 少 量 緩 沖 液 的 酶 液 加 入 ， 振 蕩 可 攪 拌 一 定 時(shí) 間 后 ，便 得 固 定 化 酶 。 其 原 理 是 ： 親 水 性 載 體 可 在 其 表 面 形 成 一 層 水膜 ， 酶 分 子 不 溶 于 溶 劑 ， 只 能 存 在 于 這 層 水 膜 中 ， 因 而 可 以 完全 被 固 定 化 o 微 晶 體 法 將 可 結(jié) 晶 的 物 質(zhì) 和 酶 溶 液 混 合 在 一 起 ， 然

11、 后 滴 入 親水 有 機(jī) 溶 劑 中 ， 當(dāng) 可 結(jié) 晶 物 質(zhì) 結(jié) 晶 析 出 時(shí) ， 酶 就 有 規(guī) 則 吸 附 在晶 體 表 面 上o 電 沉 積 法 。 在 酶 溶 液 中 放 置 兩 個(gè) 電 極 ， 在 電 極 臨 近 加 入 載 體 ，通 電 后 ， 酶 移 向 電 極 ， 并 沉 積 到 載 體 表 面 的 固 定 化 方 法 。 采 用這 種 方 法 時(shí) 需 事 先 確 定 載 體 和 酶 在 電 場(chǎng) 中 是 否 會(huì) 分 解 和 失 活 。在 沉 積 過(guò) 程 中 和 酶 活 性 、 穩(wěn) 定 性 有 關(guān) 的 某 些 離 子 如 果 發(fā) 生 移 除 、損 漏 ， 那 么 就 必

12、須 即 時(shí) 補(bǔ) 充 、 替 代 。 (2) 共 價(jià) 結(jié) 合 法 o 借 助 共 價(jià) 鍵 將 酶 的 活 性 非 必須 側(cè) 鏈 基 團(tuán) 或 細(xì) 胞 表 面 基 團(tuán)（ 如 氨 基 、 羧 基 、 羥 基 、 巰基 、 咪 唑 基 等 ） 和 載 體 的 功能 基 團(tuán) 進(jìn) 行 偶 聯(lián) 以 達(dá) 到 固 定化 目 的 方 法 。o 此 法 得 到 的 固 定 化 酶 結(jié) 合 牢固 、 穩(wěn) 定 性 好 、 利 于 連 續(xù) 使用 ， 因 此 它 是 目 前 應(yīng) 用 最 多的 一 類 固 定 化 酶 的 方 法 。 共 價(jià) 偶 聯(lián) 法 的 優(yōu) 點(diǎn) ： 得 到 的 固 定 化 酶 結(jié) 合 牢 固 、 穩(wěn) 定 性

13、好 、 利 于 連 續(xù) 使 用 。共 價(jià) 偶 聯(lián) 法 的 缺 點(diǎn) ： 載 體 活 化 的 操 作 復(fù) 雜 ， 反 應(yīng) 條 件 激烈 ， 需 要 嚴(yán) 格 控 制 條 件 才 可 以 獲 得 較 高 活 力 的 固 定 化 酶 。同 時(shí) 共 價(jià) 結(jié) 合 會(huì) 影 響 到 酶 的 空 間 構(gòu) 象 ， 從 而 對(duì) 酶 的 催 化活 性 產(chǎn) 生 影 響 。共 價(jià) 偶 聯(lián) 法 的 優(yōu) 點(diǎn) 、 缺 點(diǎn) 共 價(jià) 結(jié) 合 法 example 纖 維 素 +鹽 酸 甲 醇CMC 甲 酯 肼CMC 酰 肼CMC 疊 氮 化 物 NH 2 酶亞 硫 酸 鈉鹽 酸固 定 化 酶 CH2CO-NH 酶 CMC CH2COO

14、H制 備 酰 肼疊 氮 化 物羧 甲 基 纖 維 素 疊 氮 法 制 備 固 定 化 葡 萄 糖 淀 粉 酶 程 序l重 氮 法l溴 化 氰 法l烷 基 化 （ 三 氯 勻 三 嗪 ）l疊 氮 法 A 重 氮 法o 反 應(yīng) 式 及 原 理 B 疊 氮 法o 例o 用 羧 甲 基 纖 維 素 疊 氮 衍 生 物 制 備 固 定 化 胰 蛋白 酶 ， 步 驟 如 下 ：o 酯 化o 肼 解o 疊 氮 化o (4) 偶 聯(lián) B 疊 氮 法o 對(duì) 含 有 羧 基 的 載 體 ， 與 肼 基 作 用 生 成 含 有 酰 肼 基 團(tuán) 的 載 體 ， 再 與 亞硝 酸 活 化 ， 生 成 疊 氮 化 合 物

15、 。 最 后 與 酶 偶 聯(lián) 。與 酶 中 的 氨 基 、 羥 基 、 巰 基 反 應(yīng) 。 C 烷 基 化 反 應(yīng) 法o 含 羥 基 的 載 體 可 用 三 氯 三 嗪 等 多 鹵 代 物 進(jìn) 行 活化 ， 形 成 含 有 鹵 素 基 團(tuán) 的 活 化 載 體 。與 酶 中 的 氨 基 、 羥 基 、 巰 基 反 應(yīng) 。 D 硅 烷 化 法o 多 孔 玻 璃 特 點(diǎn) ：o 機(jī) 械 強(qiáng) 度 好 ， 表 面 積 大 。o 耐 有 機(jī) 溶 劑 和 微 生 物 破 壞 。 載 體 可 以 再生 ， 壽 命 長(zhǎng) 等 。 D 硅 烷 化 法o 一 般 常 用 的 載 體 ： 多 孔 玻 璃 ， 多 孔 陶

16、瓷 。 D 硅 烷 化 法 D 硅 烷 化 法 D 硅 烷 化 法 E 溴 化 氰 法o 本 方 法 主 要 用 溴 化 氰 （ CNBr） 活 化 多 糖 類 物 質(zhì) 。如 纖 維 素 、 葡 聚 糖 、 瓊 脂 糖 等 ， 其 中 以 瓊 脂 糖為 載 體 的 占 多 數(shù) （ 大 孔 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) ） 。 用 溴 化 氰法 活 化 瓊 脂 糖 制 備 得 到 的 固 定 化 酶 目 前 使 用 很廣 ， 特 別 用 作 親 和 層 析 ， 有 著 良 好 的 性 能 。 E 溴 化 氰 法與 酶 中 的 氨 基 反 應(yīng) 1) 載 體 的 物 化 性 質(zhì) 要 求 載 體 親 水 (避 免

17、吸 附 )， 并 且 有一 定 的 機(jī) 械 強(qiáng) 度 和 穩(wěn) 定 性 ， 同 時(shí) 具 備 在 溫 和 條 件 下 與 酶結(jié) 合 的 功 能 基 團(tuán) 。2) 偶 聯(lián) 反 應(yīng) 的 反 應(yīng) 條 件 必 須 在 溫 和 pH 、 中 等 離 子 強(qiáng) 度和 低 溫 的 緩 沖 溶 液 中 。3) 所 選 擇 的 偶 聯(lián) 反 應(yīng) 要 盡 量 考 慮 到 對(duì) 酶 的 其 它 功 能 基團(tuán) 副 反 應(yīng) 盡 可 能 少 。4) 要 考 慮 到 酶 固 定 化 后 的 構(gòu) 型 ， 盡 量 減 少 載 體 的 空 間位 阻 對(duì) 酶 活 力 的 影 響 。共 價(jià) 偶 聯(lián) 法 固 定 化 酶 的 幾 個(gè) 影 響 因 素共

18、 價(jià) 偶 聯(lián) 法 成 功 的 關(guān) 鍵 在 于 載 體 的 選 擇 、 偶 聯(lián) 反 應(yīng) 、偶 聯(lián) 反 應(yīng) 過(guò) 程 中 的 活 性 保 護(hù) 和 偶 聯(lián) 量 的 多 少 。 此 法 固定 化 細(xì) 胞 的 報(bào) 導(dǎo) 甚 少 ， 它 的 發(fā) 展 有 賴 于 新 的 溫 和 偶 聯(lián)方 法 和 生 物 相 容 性 好 的 偶 聯(lián) 試 劑 的 開(kāi) 發(fā) (3) 交 聯(lián) 法o 利 用 雙 功 能 或 多 功 能 試劑 在 酶 分 子 間 、 或 酶 分子 與 惰 性 蛋 白 間 進(jìn) 行 交聯(lián) 反 應(yīng) 以 制 備 固 定 化 酶的 方 法 。o 常 用 的 試 劑 有 戊 二 醛 、甲 苯 二 異 氰 酸 酯 、 乙

19、 烯 -馬 來(lái) 酸 酐 共 聚 物 等 。o 交 聯(lián) 法 操 作 簡(jiǎn) 便 ， 但 交聯(lián) 反 應(yīng) 往 往 比 較 激 烈 ，許 多 酶 容 易 在 固 定 化 過(guò)程 中 失 活 ， 酶 回 收 率 不高 。 交 聯(lián) 法o 發(fā) 生 作 用 的 氨 基 酸 殘 基 ： 酪 氨 酸 的 酚 基 胱 氨 酸 的 SH 巰 基 N 末 端 的 a 氨 基o 常 用 的 雙 功 能 或 多 功 能 試 劑 ： 戊 二 醛 聚 甲 叉 雙 碘 乙 酰 胺 雙 重 氮 聯(lián) 苯 胺 共 價(jià) 交 聯(lián) 法 的 四 種 形 式1） 酶 直 接 交 聯(lián) 法 在 酶 液 中 加 入 適 量 多 功 能 試 劑 ， 使 其

20、形 成不 溶 性 衍 生 物 。 固 定 化 依 賴 于 酶 與 試 劑 的 濃 度 、溶 液 pH 和 離 子 強(qiáng) 度 、 溫 度 和 反 應(yīng) 時(shí) 間 之 間 的 平衡 。 操 作 簡(jiǎn) 單 ， 但 是 缺 乏 選 擇 性 ， 活 力 回 收 往 往不 高 。 2 ） 酶 輔 助 蛋 白 交 聯(lián) ： 當(dāng) 可 得 到 的 酶 量 有 限 ， 可 以 使 用 第 二 個(gè) “ 載體 ” 蛋 白 來(lái) 增 加 蛋 白 質(zhì) 濃 度 ， 從 而 使 酶 與 惰 性 蛋白 共 交 聯(lián) 的 方 法 。 這 種 “ 載 體 ” 蛋 白 即 輔 助 蛋 白 ， 可 以 是 白 蛋 白 、明 膠 、 血 紅 蛋 白

21、等 。 3） 吸 附 交 聯(lián) 法 ：此 法 先 將 酶 吸 附 在 硅 膠 、 皂 土 、 氧 化 鋁 、 球 狀酚 醛 樹(shù) 脂 或 其 他 大 孔 型 離 子 交 換 樹(shù) 脂 上 ， 再 用戊 二 醛 等 雙 功 能 試 劑 交 聯(lián) ， 用 此 法 所 得 固 定 化酶 也 可 稱 為 殼 狀 固 定 化 酶 。 4） 載 體 交 聯(lián) 法 ： 用 多 功 能 試 劑 的 一 部 分 功 能基 團(tuán) 化 學(xué) 修 飾 高 聚 物 載 體 ， 而 其 中的 另 一 部 分 功 能 基 團(tuán) 偶 聯(lián) 酶 蛋 白 。 (4)包 埋 法o 通 過(guò) 物 理 或 化 學(xué) 的 方 法 將 酶 或 細(xì) 胞 限 制

22、在 一 定 的 空 間 范 圍 內(nèi) ，底 物 和 產(chǎn) 物 能 自 由 擴(kuò) 散 ， 從 而 達(dá) 到 重 復(fù) 利 用 生 物 質(zhì) 的 一 種 固定 化 方 法 。 此 方 法 是 固 定 化 細(xì) 胞 的 最 主 要 方 法 。o 包 埋 法 可 分 為 格 型 包 埋 和 微 囊 型 包 埋 。 前 者 是 將 酶 或 細(xì) 胞 分散 包 埋 在 聚 合 物 的 膠 格 中 ， 如 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 、 卡 拉 膠 、 聚乙 烯 醇 、 海 藻 酸 鈣 等 ； 后 者 是 將 一 定 量 的 酶 或 細(xì) 胞 包 在 半 透膜 內(nèi) ， 如 尼 龍 膜 、 醋 酸 纖 維 、 NaCS/PDM

23、DAAC膠 囊 等 。 此 法制 備 條 件 溫 和 、 生 物 相 容 性 好 ， 但 僅 可 用 于 低 分 子 量 的 底 物 ，且 常 受 擴(kuò) 散 限 制 。 微 膠 囊 特 點(diǎn)o 微 囊 直 徑 幾 微 米 幾百 微 米 。o 低 分 子 底 物 可 以 自 由通 過(guò) 并 進(jìn) 入 微 囊 內(nèi) 。o 酶 本 身 是 高 分 子 物 質(zhì)不 能 通 過(guò) 微 囊 而 被 留在 微 囊 中 ，o 外 部 的 蛋 白 分 解 酶 、抗 體 等 高 分 子 物 質(zhì) 也無(wú) 法 進(jìn) 入 微 囊 內(nèi) E EECo-enzymesSubstratesProducts Enzymes Macromolecu

24、lesoutside the capsulesCapsule membrane 包 埋 法 的 優(yōu) 點(diǎn)在 于 它 是 一 種 反 應(yīng) 條 件 溫 和 、 很 少 改 變 酶 結(jié) 構(gòu) 但 是 又較 牢 固 的 固 定 化 方 法 。 包 埋 法 的 缺 點(diǎn)是 只 有 小 分 子 底 物 和 產(chǎn) 物 可 以 通 過(guò) 高 聚 物 網(wǎng) 架 擴(kuò) 散 ，對(duì) 那 些 底 物 和 產(chǎn) 物 是 大 分 子 的 酶 并 不 適 合 。 這 是 由 于高 聚 物 網(wǎng) 架 會(huì) 對(duì) 大 分 子 物 質(zhì) 產(chǎn) 生 擴(kuò) 散 阻 力 導(dǎo) 致 固 定 化酶 動(dòng) 力 學(xué) 行 為 改 變 ， 使 活 力 降 低 。包 埋 法 的 優(yōu)

25、 點(diǎn) 、 缺 點(diǎn) 微 囊 化 制 備 方 法微 囊 法 主 要 將 酶 封 裝 在 膠 囊 、 脂 質(zhì) 體 和 中 空 纖 維 中 。 膠 囊和 脂 質(zhì) 體 主 要 用 于 醫(yī) 學(xué) 治 療 ， 中 空 纖 維 主 要 適 于 工 業(yè) 使用 。微 囊 制 備 方 法（ 1） 界 面 沉 淀 法 是 一 種 簡(jiǎn) 單 的 物 理 微 囊 化 法 ， 它 是 利 用 某些 高 聚 物 在 水 相 和 有 機(jī) 相 的 界 面 上 溶 解 度 較 低 而 形 成 的皮 膜 將 酶 包 埋 。（ 2） 界 面 聚 合 法 有 機(jī) 溶 液 中 添 加 表 面 活 性 劑 使 之 乳 化 形 成油 包 水 結(jié)

26、構(gòu) ,再 用 單 體 分 子 在 界 面 聚 合 ,達(dá) 到 包 埋 目 的 的一 種 方 法 。 （ 3） 原 位 聚 合 沒(méi) 有 界 面 發(fā) 生 的 聚 合 反 應(yīng) 成 膜 A 乳 化 分 散 ： 取 含 有 酶 和 親 水 性 單 體 的 水 溶 液 ， 在 不溶 于 水 的 有 機(jī) 溶 媒 中 充 分 乳 化 。B 表 面 聚 合 ： 將 含 有 疏 水 性 單 體 的 有 機(jī) 溶 媒 加 入 到 上述 乳 化 液 中 ， 發(fā) 生 聚 合 反 應(yīng) ， 生 成 的 薄 膜 把 酶 包 圍 起來(lái) 形 成 微 型 膠 囊 球 。C 清 洗 ： 反 應(yīng) 完 成 后 ， 用 有 機(jī) 溶 劑 洗 去

27、 未 反 應(yīng) 的 剩余 單 體 1界 面 聚 合 法 微 膠 囊 的 制 備 （ example)-原 位 聚 合o NaCS (Sodium Cellulose Sulphate） 纖 維 素 硫 酸 鈉 o PDMDAAC (Polydimethyldiallylammonium Chloride，聚 二 甲 基 二 烯 丙 基 氯 化 銨o 這 兩 種 物 質(zhì) 均 是 能 溶 于 水 的 聚 電 解 質(zhì) 。 NaCS是 聚 陰離 子 化 合 物 ， PDMDAAC為 聚 陽(yáng) 離 子 化 合 物 ， 當(dāng) 這 兩種 帶 不 同 電 荷 的 物 質(zhì) 混 合 時(shí) ， 在 兩 者 的 界 面 發(fā)

28、生 絡(luò) 合反 應(yīng) ， 生 成 多 聚 電 解 質(zhì) 復(fù) 合 體 （ PEG， Polyelectrolyte Complexe， 形 成 了 一 層 半 透 膜 。 OO* O *HO OHCH2OSO3-Na+ HOH2C nOHHOH 2C H2C *N+H3C CH3* Cl- n NaCS-PDMDAAC微 膠 囊 制 備 的 反 應(yīng) 過(guò) 程 示 意 圖 NaCS PDMDAAC PDMDAACro NaCSro r i rarb 固 定 化 酶 的 制 法 及 其 特 性 比 較 特 性 制 備 方 法共 價(jià) 鍵結(jié) 合 法 離 子結(jié) 合 法 物 理吸 附 法 包 埋 法制 法 難 易

29、易 難酶 活 力 高 高 高低底 物 特 異 性 易 變 不 變 不 變 不 變結(jié) 合 能 力 強(qiáng) 中 弱 弱再 生 不 可 可 能 可 能 不 可交 聯(lián) 法難中易 變強(qiáng)不 可 固 定 化 酶 的 保 存 方 法使 用 時(shí) 固 定 化 酶 的 保 存 是 一 個(gè) 很 重 要 的 環(huán) 節(jié) 。 1 真 空 冷 凍 干 燥 保 存 （ 長(zhǎng) 期 保 存 ） 2 低 溫 保 存 3 多 孔 玻 璃 的 無(wú) 機(jī) 質(zhì) 載 體 比 纖 維 素 等 的 有 機(jī) 質(zhì) 載 體 更 適 于 長(zhǎng) 期 保 存 。 4 無(wú) 機(jī) 質(zhì) 載 體 中 ， 以 重 氮 結(jié) 合 法 制 備 的 固 定 化 酶 具 有 較 好 的 保

30、存 性 。 (三 ) 固 定 化 酶 特 性固 定 化 后 酶 會(huì) 發(fā) 生( )（ 載 體 酶 ） 構(gòu) 象 變 化 微 擾 立 體 屏 蔽 酶 特 異 性 (Km) 穩(wěn) 定 性 以 及 最 適 溫 度( )（ 載 體 底 物 ） 分 配 效 應(yīng) 擴(kuò) 散 效 應(yīng) 最 適 pH變 化 立 體 屏 蔽 ： 是 由 于 載 體 的 孔 隙 太 小 ， 或 是 由 于固 定 化 的 方 式 與 位 置 不 當(dāng) ， 給 酶 的 活 性 中 心或 調(diào) 節(jié) 中 心 造 成 了 空 間 障 礙 ， 因 而 底 物 與 效應(yīng) 物 無(wú) 法 和 酶 接 觸 ， 從 而 影 響 酶 活 性 的 一 種效 應(yīng) 。 這 種

31、 效 應(yīng) 也 難 于 定 量 描 寫(xiě) ， 多 見(jiàn) 于 包埋 ， 吸 附 法 或 共 價(jià) 偶 聯(lián) 法 。微 擾 ： 是 由 于 載 體 的 親 水 、 疏 水 性 質(zhì) 和 介 質(zhì) 的介 電 常 數(shù) 等 直 接 影 響 酶 的 催 化 能 力 或 酶 對(duì) 效應(yīng) 物 作 出 反 應(yīng) 能 力 的 一 種 效 應(yīng) 。 這 種 效 應(yīng) 更難 于 定 量 描 寫(xiě) 和 預(yù) 見(jiàn) ， 但 是 通 過(guò) 改 變 載 體 與介 質(zhì) 的 性 質(zhì) 可 作 出 判 斷 與 調(diào) 節(jié) 。 空 間 障 礙 效 應(yīng) (立 體 屏 蔽 ) 固 定 化 之 后 ， 由 于 酶 的 空 間 自 由 度 受 到 限 制 (因 為 載體 的

32、空 隙 太 小 ， 或 者 固 定 化 方 式 與 位 置 不 當(dāng) ， 給 酶的 活 性 部 位 造 成 了 空 間 屏 障 )， 使 酶 分 子 的 活 性 基 團(tuán)不 易 于 底 物 或 效 應(yīng) 物 接 觸 ， 影 響 酶 分 子 的 分 子 活 性中 心 對(duì) 底 物 的 定 位 作 用 ,所 造 成 的 對(duì) 固 定 化 酶 的 活 力的 影 響 效 應(yīng) ， 被 稱 為 空 間 障 礙 效 應(yīng) 。 分 配 效 應(yīng) 由 于 載 體 和 底 物 的 性質(zhì) 差 異 引 起 了 微 環(huán) 境和 宏 觀 環(huán) 境 之 間 的 性質(zhì) 不 同 。 微 環(huán) 境 是 在固 定 化 酶 附 近 的 局 部環(huán) 境 ，

33、 而 將 主 體 溶 液稱 為 宏 觀 環(huán) 境 。 由 這種 不 同 造 成 的 底 物 、產(chǎn) 物 和 各 種 效 應(yīng) 物 在兩 個(gè) 環(huán) 境 之 間 的 不 同分 配 ， 被 稱 為 分 配 效應(yīng) 。 擴(kuò) 散 限 制 效 應(yīng) 酶 固 定 化 使 生 物 催 化 反 應(yīng) 從 均 相 轉(zhuǎn) 化 為 多 相 ， 于 是 產(chǎn) 生 了 擴(kuò)散 阻 力 ： 1） 、 外 擴(kuò) 散 阻 力 是 底 物 從 宏 觀 環(huán) 境 向 酶 顆 粒 表 面 傳 遞 過(guò) 程 中的 一 種 擴(kuò) 散 限 制 效 應(yīng) ， 它 發(fā) 生 在 反 應(yīng) 之 前 ， 發(fā) 生 在 固 定 化 顆粒 周 圍 的 液 膜 層 。 它 會(huì) 使 底 物

34、 在 固 相 酶 周 圍 形 成 濃 度 梯 度 ，通 過(guò) 增 加 攪 拌 速 度 和 底 物 流 速 的 方 法 可 以 減 少 外 擴(kuò) 散 效 應(yīng) 。 2） 內(nèi) 擴(kuò) 散 阻 力 是 指 底 物 分 子 達(dá) 到 固 相 酶 表 面 后 傳 遞 到 酶 活 性部 位 時(shí) 的 一 種 擴(kuò) 散 阻 力 ， 它 與 催 化 反 應(yīng) 同 時(shí) 進(jìn) 行 。 載 體 小 而 彎 曲 的 細(xì) 孔 是 產(chǎn) 生 內(nèi) 擴(kuò) 散 阻 力 的 要 原 因 。 因 此 使 用低 分 子 量 底 物 ， 小 的 粒 徑 、 載 體 孔 盡 可 能 大 而 直 且 互 相 連 通 ，或 僅 僅 將 酶 固 定 在 載 體 表

35、面 都 可 以 降 低 這 種 內(nèi) 擴(kuò) 散 阻 力 。 固 定 化 酶 的 特 性具 體 表 現(xiàn) 在 如 下 特 性 ：o 穩(wěn) 定 性 (一 般 升 高 ) 1)固 定 化 后 的 酶 與 載 體 多 點(diǎn) 連 接 ， 可 防 止 酶 分 子 伸 展 變 形 。 2)抑 制 自 降 解 ， 提 高 了 酶 穩(wěn) 定 性o 最 適 溫 度 變 化 （ 一 般 升 高 ， 但 有 些 酶 仍 然 會(huì) 降 低 ，如 烷 基 化 固 定 的 氨 基 酰 化 酶 ）o 最 適 pH （ 受 底 物 影 響 和 載 體 影 響 發(fā) 生 偏 移 動(dòng) ）o 底 物 特 異 性 （ 由 于 空 間 障 礙 妨 礙

36、底 物 接 觸 而 影 響Km值 ） 固 定 化 酶 最 適 pH變 化o 底 物 （ 擴(kuò) 散 限 制 ）如 酸 性 底 物 停 留 在 酶分 子 周 圍 ， 使 酶 表 面pH降 低 ， 需 要 升 高 溶液 pH值 才 能 達(dá) 到 原 來(lái)最 優(yōu) pH 氫 離 子 底 物 滯 留 在 酶 表 面 降 低 宏 觀 H +(升 高 pH) 固 定 化 酶 最 適 pH變 化o 載 體 （ 分 配 效 應(yīng) ）陰 離 子 載 體 要 達(dá) 到 自 由 酶表 面 氫 離 子 水平 （ 最 優(yōu) pH） ,必 須 升 高 宏 觀溶 液 中 OH濃 度 ,減 少 分 配 進(jìn) 入載 體 的 氫 離 子 二 細(xì)

37、胞 的 固 定 化o 細(xì) 胞 固 定 化 所 用 的 方 法o 固 定 化 細(xì) 胞 的 特 性1、 可 增 殖 ， 細(xì) 胞 密 度 大 ， 可 獲 得 高 度 密 集 而 體 積 小 的 生 產(chǎn) 菌 集 合 體2、 發(fā) 酵 穩(wěn) 定 性 好 ， 可 以 較 長(zhǎng) 時(shí) 間 反 復(fù) 使 用 或 連 續(xù) 使 用 。3、 發(fā) 酵 液 中 含 菌 體 較 少 ， 有 利 于 產(chǎn) 品 分 離 純 化 。4、 有 利 于 需 要 輔 酶 和 多 酶 系 統(tǒng) 才 能 進(jìn) 行 的 反 應(yīng) 。 (一 ) 細(xì) 胞 固 定 化 所 用 的 方 法o 吸 附 法 （ 依 據(jù) 細(xì) 胞 特 性 選 擇 吸 附 載 體 ） (1

38、) 酵 母 （ 負(fù) 電 荷 ） 多 孔 陶 瓷 和 塑 料 (2) 霉 菌 （ 菌 絲 體 長(zhǎng) ） 金 屬 網(wǎng) 絲 (3) 植 物 細(xì) 胞 中 孔 纖 維 外 壁 (4) 動(dòng) 物 細(xì) 胞 （ 貼 壁 細(xì) 胞 ） 容 器 壁 細(xì) 胞 固 定 化 所 用 的 方 法o 包 埋 法 包 埋 實(shí) 質(zhì) 上 是 酶 周 圍 聚 合 (連 接 )的 過(guò) 程(1)溫 度 誘 導(dǎo) 的 交 聯(lián) 瓊 脂 （ 機(jī) 械 強(qiáng) 度 差 ， 擴(kuò) 散 困 難 ） 甲 叉 菜 膠 明 膠(2) 離 子 誘 導(dǎo) 交 聯(lián) 海 藻 酸 鈣(3)光 等 誘 導(dǎo) 的 交 聯(lián) 1) 聚 丙 烯 酰 胺 2)光 交 聯(lián) 樹(shù) 脂 （ 聚 氨 酯

39、 預(yù) 聚 物 ， 光 敏 劑 ， 光 ） 2.4%左 右 的 卡 拉 膠 ， 70 溶 解 , 再 冷 卻 到 42 , +10%左 右 的 細(xì) 菌 菌 體 (預(yù) 熱 到 42 ） 迅 速 混 合 均 勻 4 冰 箱 放 置 大 約 30min 取 出 后 切 成 3 3mm的 小 顆 粒 Example:卡 拉 膠 包 埋 Example 海 藻 酸 鈣 包 埋 法將 水 溶 性 的 海 藻 酸 鈉 配 成 水 溶 液 ，并 把 酶 或 細(xì) 胞 分 散 在 其 中 ， 然 后 將其 滴 入 凝 固 浴 中 （ 常 用 CaCl2 溶液 ） ， 使 海 藻 酸 鈉 中 的 Na+， 部 分被

40、Ca+所 取 代 而 形 成 由 多 價(jià) 離 子 交聯(lián) 的 離 子 網(wǎng) 絡(luò) 凝 膠 。 海 藻 酸 鈉 Ca+ Ca+ro 海 藻 酸 鈉ro ri rarb注 意 ：(1) 乳 酸 和 磷酸 等 對(duì) 其 干 擾 (2) capsule和bead區(qū) 別 ； 正滴 和 反 滴 的 區(qū)別 Exmaple聚 丙 烯 酰 胺 包 埋 固 定 化 細(xì) 胞酶 液丙 烯 酰胺N， N雙 丙 烯 酰 胺 催 化 劑 為 過(guò) 硫 酸 鉀 、 核 黃 素光 照 聚 合 反 應(yīng) 凝 膠 酶 塊固 定 化酶 切割 (二 ) 固 定 化 細(xì) 胞 的 特 性o 對(duì) 菌 體 提 高 了 細(xì) 胞 密 度 ， 提 高 產(chǎn) 率o

41、 對(duì) 植 物 分 散 了 細(xì) 胞 （ 用 于 研 究 或 利 于 傳 遞 底 物 ）o 對(duì) 動(dòng) 物 由 于 容 易 和 底 物 分 離 ， 從 而 可 實(shí) 現(xiàn)菌 體 生 長(zhǎng) 和 發(fā) 酵 條 件 的 控 制 細(xì) 胞 特 性 比 較 (固 定 化 中 要 注 意 事 項(xiàng) ）細(xì) 胞 種 類 植 物 細(xì) 胞 微 生 物 細(xì) 胞 動(dòng) 物 細(xì) 胞細(xì) 胞 大 小 /um 20-300 1-10 10-100倍 增 時(shí) 間 /h 12 0.3-6 15營(yíng) 養(yǎng) 要 求 簡(jiǎn) 單 簡(jiǎn) 單 復(fù) 雜光 照 要 求 大 多 數(shù) 要 光 照 不 要 求 不 要 求對(duì) 剪 切 力 敏 感 大 多 數(shù) 不 敏 感 敏 感 主

42、要 產(chǎn) 物 色 素 、 藥 物 、 香 精 、酶 等 醇 、 有 機(jī) 酸 、 氨 基 酸 、抗 生 素 、 核 苷 酸 、酶 疫 苗 、 激 素 、抗 體 、 酶 三 輔 酶 的 固 定 化o 原 因有 機(jī) 輔 因 子 中 具 有 某 些 特 殊 的 化 學(xué) 基 團(tuán) ， 參 與 酶的 催 化 反 應(yīng) 中 有 機(jī) 輔 因 子 在 使 用 過(guò) 程 中 要 流 失 ，并 且 不 能 自 行 再 生 有 機(jī) 輔 因 子 價(jià) 格 昂 貴工 業(yè) 上 應(yīng) 用 全 酶 的 關(guān) 鍵 是 有 機(jī) 輔 因 子 的 保 留 和 再生 輔 酶 的 固 定 化o 方 法 固 定 化 方 法 與 酶 相 似 ， 一般 采 用 溴 化 氰 法 ， 碳 二 亞胺 法 以 及 重 氮 偶 聯(lián) 法 等 共價(jià) 偶 聯(lián) ， 或 將 其 進(jìn) 行 適 當(dāng)?shù)?化 學(xué) 修 飾 后 固 定 在 超 濾器 中o 問(wèn) 題 輔 酶 固 定 化 必 須 解 決 輔 酶在 多 個(gè) 酶 之 間 傳 遞 的 障 礙 。 輔 酶 的 固 定 化 （ example）