高中生物 專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題3 血紅蛋白的提取與分離課件 新人教版選修1.ppt
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成才之路 生物,路漫漫其修遠(yuǎn)兮 吾將上下而求索,人教版 選修1,DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),專題五,課題3 血紅蛋白的提取與分離,專題五,1.掌握提取生物大分子的基本過程和方法。(重點(diǎn)) 2.理解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。(重、難點(diǎn)) 3.嘗試對(duì)血液中的血紅蛋白進(jìn)行提取和分離。,一、凝膠色譜法 1.概念:也稱做___________,是根據(jù)________________分離蛋白質(zhì)的有效方法。 2.原理 當(dāng)_______________不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量________的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程________,移動(dòng)速度________,而相對(duì)分子質(zhì)量________的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在____________移動(dòng),路程________,移動(dòng)速度________,從而使_______________不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。,分配色譜法,相對(duì)分子質(zhì)量大小,相對(duì)分子質(zhì)量,較小,較大,較慢,較大,凝膠外部,短,快,相對(duì)分子質(zhì)量,二、緩沖溶液 1.作用:在一定范圍內(nèi),抵制________的________對(duì)溶液pH的影響,維持pH__________。 2.配制:由________種緩沖劑溶解于________中配制而成,通過調(diào)節(jié)緩沖劑的________就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,外界,酸和堿,相對(duì)穩(wěn)定,1~2,水,使用比例,三、電泳 1.概念:指________在電場(chǎng)的作用下發(fā)生的________的過程。 2.原理:在一定的________下,________、________等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上________或________,在________的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷________的電極移動(dòng)。,帶電粒子,遷移,pH,多肽,核酸,正電,負(fù)電,電場(chǎng),相反,3.作用:電泳利用了待分離樣品中各種分子________的差異及分子本身的________、________的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的________,從而實(shí)現(xiàn)樣品中__________的分離。 4.方法:常用的電泳方法有________________和___________________。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用______________________________。,帶電性質(zhì),大小,形狀,遷移速度,各種分子,瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝胺電泳,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,四、實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步:________、________、________和__________。 1.樣品處理 (1)紅細(xì)胞的洗滌:目的是____________。采用__________離心,吸取血漿后加________洗滌,直至上清液中沒有________,表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 (2)血紅蛋白的釋放:在________和________的作用下,紅細(xì)胞破裂,釋放出血紅蛋白。,樣品處理,粗分離,純化,純度鑒定,去除雜蛋白,低速短時(shí)間,生理鹽水,黃色,蒸餾水,甲苯,(3)分離血紅蛋白溶液:把混合液離心后,將試管中的液體用濾紙過濾,除去_____________,于分液漏斗中靜置片刻后,分離出下層的_____________。 (4)透析:透析袋能使小分子自由進(jìn)出,而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。,脂溶性沉淀層,紅色透明液體,2.凝膠色譜操作 (1)凝膠色譜柱的制作:準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱。 (2)凝膠色譜柱的裝填。 (3)樣品的加入和洗脫。其基本過程是調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)。至此,血紅蛋白即可得到粗分離。 3.純度鑒定:在鑒定的方法中,使用最多的是_________________________。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,五、操作提示 1.紅細(xì)胞的洗滌:_________、__________與__________十分重要。洗滌次數(shù)過少,無法除去________;離心速度_____和時(shí)間_____會(huì)使______等一同沉淀,達(dá)不到分離效果。 2.色譜柱填料的處理:商品凝膠使用前需直接放在________中膨脹,可以將加入其中的濕凝膠用____________,加速膨脹。 3.凝膠色譜柱的裝填:在裝填凝膠柱時(shí),不能有________存在。因其能攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的________,降低分離效果。 4.蛋白質(zhì)的分離:如果________________________,說明色譜柱制作成功。,洗滌次數(shù),離心速度,離心時(shí)間,血漿蛋白,過高,過長(zhǎng),白細(xì)胞,洗脫液,沸水浴加熱,氣泡,洗脫次序,紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng),紅細(xì)胞破碎后混合液中含有什么成分? 紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白,而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯等。,教材P70“旁欄思考題” 凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體,小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,只能分布在顆粒之間,通過的路程較短,移動(dòng)速度較快;相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道,通過的路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢。因此,樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出,相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出,相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出,從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。,如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻,就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙,使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過,攪亂洗脫液的流動(dòng)次序,從而影響分離的效果。,(一)依據(jù)蛋白質(zhì)的特性的差異 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(如形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等)千差萬別,由此可提取和分離各種蛋白質(zhì)。,血紅蛋白提取和分離的方法,(二)蛋白質(zhì)的分離方法:凝膠色譜法 1.概念:凝膠色譜法也稱做分配色譜法,是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 2.原理:大多數(shù)凝膠由糖類化合物構(gòu)成的小球體,內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動(dòng),路程較短,移動(dòng)速度較快。,(三)緩沖溶液 1.作用:在一定范圍內(nèi),緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響,維持pH基本不變。 2.配制:通常由1~2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,(四)電泳 1.概念:帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。 2.原理:許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán),在一定pH下,這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,電泳利用了除哪些性質(zhì)外使樣品中各種分子分離( ) A.帶電性質(zhì)差異 B.分子的大小 C.分子的形狀 D.分子的變性溫度 [解析] 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程,帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會(huì)影響帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移速度。 [答案] D,導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350412,利用凝膠色譜法,什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來( ) A.相對(duì)分子質(zhì)量大的 B.溶解度高的 C.相對(duì)分子質(zhì)量小的 D.所帶電荷多的 [答案] A [解析] 凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道,路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢;相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì),路程較短,移動(dòng)速度較快,首先洗脫出來。,導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350413,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步:樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。,提取和分離血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)操作,(二)凝膠色譜操作的主要步驟,,3.純度鑒定——SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求,需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中,使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。,4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià),蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步( ) A.樣品處理、凝膠色譜操作、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳 B.樣品處理、凝膠色譜操作、純化 C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定 D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定 [解析] 蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳為實(shí)驗(yàn)操作過程中的技術(shù)。 [答案] C,導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350414,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過程,可表示為下圖中哪一個(gè)( ) [答案] B,,導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350415,[解析] 本題考查對(duì)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理的理解,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量越大,越容易通過凝膠間隙而先被洗脫,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量越小則易進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。,一、蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析 特別提示:凝膠色譜的原理是相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠孔道,路程長(zhǎng),移動(dòng)速度慢;而相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)在凝膠外部移動(dòng),路程短,移動(dòng)快,這種現(xiàn)象又稱分子篩效應(yīng)。,二、樣品處理、分離與純化的目的不同,[答案] 較慢 較快 pH 帶電性質(zhì) 凝膠色譜法,,- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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