【基金標書】2010CB912200-基因組穩(wěn)定性和細胞周期調控相關蛋白質群的功能及作用機制研究

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項目名稱： 基因組穩(wěn)定性和細胞周期調控相關蛋白質群的功能及作用機制研究首席科學家： 尹玉新 北京大學起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 教育部一、研究內容（一）擬解決的關鍵科學問題面對我國生命和健康科學的重大需求和癌癥等重大疾病研究的挑戰(zhàn)，結合我們前期的研究基礎，本項 目將圍繞遺傳物質穩(wěn)定性這一中心課題，選擇細胞周期調節(jié)的各個環(huán)節(jié)，從蛋白 質群入手解決如下關鍵科學問題：1. 蛋白質群在細胞生長分裂過程中細胞周期各個階段的調控機制和相互作用。相關的信號傳導通路在 細胞增殖過程中如何維持遺傳物質的穩(wěn)定性。細胞異常增殖過程中相關蛋白質群的變化規(guī)律及其對細胞周期和基因組穩(wěn)定性的影響。2. PTEN在有絲分裂過程中調節(jié)蛋白質群的機制。抑癌基因PTEN與p53通路之間的蛋白質網絡群的聯(lián)系。 細胞增殖和凋亡的分子調控機制，Hippo信號通路及微管結合蛋白在其中發(fā)揮的作用。（二）主要研究內容1. 研究真核細胞 DNA 復制及檢驗點維持遺傳物質穩(wěn)定性的機理，確定DNA 復制起始蛋白 Sap1 的相互作用蛋白及闡明它 們的生化功能；大規(guī)模確定新的 DNA 復制蛋白；闡明 Dna2 維持 DNA 復制叉穩(wěn)定的機理以及 Cds1-Dna2 的檢驗點通路，揭示檢驗點在維 持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用；從 G1、S 期細胞中鑒定新的受 GSK-3β調控的基因或蛋白質群，并挑 選適當的功能基因或蛋白，在 細胞水平和整體水平（動物模型）分析、驗證，且探 討其機制及意義。 2. 檢測有絲分裂期間PTEN及其調控的蛋白質群的作用機制，鑒定更多PTEN調節(jié)的與有絲分裂相關的蛋白質群；檢測PTEN與這些蛋白質群的物理性相互作用；通過基因敲除小鼠模型和轉基因小鼠模型評價有絲分裂破壞與腫瘤發(fā)生的關系；深入探討PTEN與p53調節(jié)的蛋白質群之間的分子網絡。3. 以癌癥和衰老模型為主要研究對象，對前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉移及衰老密切相關蛋白進行生物學功能及蛋白質糖基化修飾研究，探究其相互作用和信號轉導途徑，從蛋白質水平上揭示腫瘤或衰老細胞增殖異常的分子機制。研究調控細胞周期G1 和M期的新蛋白Mig-2，通過對其所調節(jié)蛋白質群的相互作用研究，揭示其調控細胞周期和腫瘤侵襲性生長的分子機制。4. 篩選 Hippo 通路上游調節(jié)蛋白及下游靶基因，探索該通路已知蛋白之間的動態(tài)互作及通路激活機制， 檢測 Hippo 通路核心蛋白調控細胞增殖與凋亡，進而影響基因組穩(wěn)定性的分子機制；探索 Hippo 信號通路與 PTEN 以及 Rassf、EB1和 CYLD 等微管結合蛋白之間的關系，解析上述各蛋白協(xié)同或獨立調控細胞增殖與凋亡、影響基因組穩(wěn)定性的分子機理。二、預期目標（一）總體目標瞄準國家戰(zhàn)略需求和國際腫瘤相關科學研究前沿，從與遺傳物質穩(wěn)定性相關蛋白質群這一關鍵科學問題出發(fā)，在細胞周期的各個環(huán)節(jié)探討相關蛋白質群的分子調控機制以及相互作用網絡。在此基礎上， 鑒 定一批新的與細胞正常、異常增殖調控相關的蛋白質群，建立全細胞水平的細胞周期相關蛋白質數據庫；確定一些與維持遺傳物質穩(wěn)定性相關的關鍵蛋白質群的結構、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的動態(tài)調控機制，并研究它們的信號調控網絡。此外， 還將探索一些與細胞周期失調后決定細胞命運的信號通路調控細胞增殖和凋亡的分子機制。通過本課題的實施將使我國在細胞周期調控相關蛋白研究的相關領域達到或領先國際水平。同時，以本項目的實施為契機, 促進蛋白 質組學、生物學、醫(yī)學、生物信息學等多學科研究的銜接和集成，培養(yǎng)一批交叉學科新型研究隊伍。（二）五年目標1. 確定DNA復制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及闡明它們的生化功能；大規(guī)模確定新的DNA復制蛋白；闡明Dna2維持DNA復制叉穩(wěn)定的機理以及Cds1-Dna2的檢驗點通路，揭示檢驗點在維持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用。鑒定G1、S期細胞中新的受GSK-3β 調控的基因或蛋白質群及其機制和意義。2. 評價PTEN及其調控的蛋白質群在控制有絲分裂中的作用并且探討PTEN對這些蛋白質群的表達調控和物理相互作用，鑒定更多與有絲分裂調控相關的蛋白質群。揭示抑癌基因PTEN與p53之間的分子網絡，為臨床診斷和化療提供理論基礎。3. 揭示蛋白質群在腫瘤發(fā)生和轉移及衰老中的生物學功能，著重研究調控細胞周期的新蛋白Mig-2的信號傳導通路，通過對其所調節(jié)的蛋白質群的研究，揭示其調控細胞周期的分子機制。通過穩(wěn)定同位素標記建立細胞核蛋白質動態(tài)表達分析鑒定的實驗方法，并由此獲得新的標志蛋白；針對所發(fā)現(xiàn)的新的相互作用蛋白，驗證其與靶蛋白的相互關系并確定其生物功能并鑒定出關鍵核蛋白質修飾類型與可用于新藥開發(fā)的重要靶標，并探討其在腫瘤治療、延緩衰老和保護細胞方面應用的可能性。4. 闡明Hippo通路各組成分子間相互作用機制，鑒定新的靶蛋白及其在Hippo通路中的作用；鑒定Hippo通路上游分子和分析通路激活機制；揭示Hippo信號通路核心分子對基因組穩(wěn)定性的調控機制；分析CYLD 和EB1等微管結合蛋白調節(jié)細胞增殖與凋亡的分子機制；探討Hippo信號通路與微管結合蛋白質群的關系及其在調控細胞分裂和誘發(fā)凋亡中的作用。5. 取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果，在國 際重要學術刊物上發(fā)表高水平論文 50 篇以上。其中，在影響因子大于 10 的刊物發(fā)表 15-20 篇，培養(yǎng)一批從事 腫瘤基礎研究和轉化醫(yī)學的交叉學科人才。三、研究方案（一）總體研究思路、技術路線及可行性分析1. 總體研究思路在細胞增殖過程中遺傳物質的穩(wěn)定性有賴于細胞周期的系統(tǒng)調節(jié)，DNA 的精確復制和DNA損傷的修復。蛋白 質群在此過程中的相互作用使 細胞周期的精密調控成為可能。機體通過細 胞周期調控維持基因組穩(wěn)定性，這一過程是經由細胞周期的各個環(huán)節(jié)實現(xiàn)的。 細胞周期分為G1、 S、G2和M期，研究細胞周期的調控應該分解到細胞周期自然過程的各個環(huán)節(jié)中。細胞周期調控的正常進行以及遺傳物質的穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生以及衰老等生命重大事件密切相關。因此，鑒定參與調控細胞周期各個環(huán)節(jié)的蛋白質群并且評價這些蛋白質群在調控細胞周期的各個階段、 維持基因組穩(wěn)定性中所發(fā)揮的作用機制以及蛋白質群之間的相互作用對于癌癥等重大疾病研究至關重要。對我們認識與了解這些疾病發(fā)生的機理，有效防治這些疾病具有重大意義?；谝陨纤悸?，本課題重點圍繞細胞周期的各個環(huán)節(jié)相關蛋白質群開展研究，闡明 這些蛋白質群在細 胞周期各個時期：DNA復制、合成、有絲分裂期的調控機制。評價蛋白質群對于 細胞周期調控正常進行，維持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用。在此基礎上，我們將利用一個大型高通量蛋白質 分析平臺，大 規(guī)模鑒定和分析與細胞周期調控和維持基因組穩(wěn)定性相關的蛋白質群，探究其相互作用蛋白和信號轉導途徑。此外，我們還將研究多細胞生物如何 處理細胞周期失調而發(fā)生遺傳物質不穩(wěn)定的情況下而對細胞命運進行調節(jié)，探討細胞生存、死亡與遺傳物質穩(wěn)定性的綜合關系，即在 細胞周期失調、基因 組不 穩(wěn)定的情況下通過何種機制調控細胞命運，對細胞生存和死亡進行決斷。 這將不 僅闡釋機體清除癌細胞的機制，還將為癌癥治療提供更多的靶向藥物選擇。細 胞 生 長 和 DNA復 制相 關 蛋 白 質 群課 題 1 有 絲 分 裂 和 DNA修 復相 關 蛋 白 質 群課 題 2細 胞 異 常 增 殖相 關 蛋 白 質 群課 題 3調 節(jié) 細 胞 增 殖 和 凋 亡蛋 白 質 群課 題 4細 胞 生 長 和 復 制相 關 蛋 白 質 群課 題細 胞 生 長 和 復 制相 關 蛋 白 質 群課 題課 題 有 絲 分 裂 和 修 復相 關 蛋 白 質 群課 題有 絲 分 裂 和 修 復相 關 蛋 白 質 群課 題課 題 細 胞 異 常 增 殖相 關 蛋 白 質 群課 題細 胞 異 常 增 殖相 關 蛋 白 質 群課 題課 題 調 節(jié) 細 胞 增 殖 和 凋 亡蛋 白 質 群課 題調 節(jié) 細 胞 增 殖 和 凋 亡蛋 白 質 群課 題課 題附圖：主要技術途徑流程圖2. 技術路線根據我們的學術思路，本項目的總體研究技術途徑如附圖所示。研究細胞周期的各個時期相關蛋白質群的結構、功能、調控機制和相互作用，并且闡述細胞正常增殖過程中遺傳物質穩(wěn)定性的維持。還將研究細胞異常增殖中蛋白質群的變化和細胞凋亡的程序控制。主要途徑為：【課題一】用遺傳的方法篩選Sap1溫度敏感株的抑制蛋白；直接從細胞內分離Sap1的蛋白復合體；用蛋白親和層析的方法分離Sap1的相互作用蛋白。并用生化，遺傳及熒光 單分子技術闡明一些已知及一些新確定的DNA復制蛋白的生化作用機理；闡明 Dna2維持DNA 復制叉穩(wěn)定的機理以及Cds1-Dna2的檢驗點通路，用基因干 擾技術 （RNAi）揭示該通路相關的檢驗點在維持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用。采用基因表達譜芯片或蛋白組學的方法，與課題 二和課題三合作，篩選受GSK-3β調控的基因或蛋白 質群，鑒定G1、S期細胞中新的受GSK-3β 調 控的基因或蛋白質群并且探討其機制和意義。 【課題二】確定PTEN在維持有絲分裂檢驗點中的重要地位，利用基因芯片技術鑒定出新的PTEN調節(jié)基因群并且深入了解其調控機理。采用染色質-免疫共沉淀（Chromatin-Immunoprecipitation, ChIP）方法確定PTEN與染色質之間的相互作用從而探討PTEN調控其靶基因表達的機理。利用蛋白質Pull-down分析系統(tǒng)大規(guī)模鑒定與PTEN相互作用的有絲分裂相關的蛋白質群。通過傳統(tǒng)的蛋白質-蛋白質相互作用實驗（IP-western）、定向誘變、熒光素酶分析等方法檢測PTEN與這些新鑒定出的有絲分裂相關蛋白質群的物理性相互作用，利用課題組三的蛋白質分析平臺鑒定PTEN與這些蛋白質群物理性相互作用的結構域及蛋白質修飾位點。通過建立小鼠動物模型從活體角度綜合評價PTEN通路以及相關蛋白質群在調節(jié)有絲分裂進程、維持遺傳物質穩(wěn)定性的重要性。最后利用這一動物模型揭示抑癌基因p53與PTEN的分子網絡關系及其在抗癌過程中的作用。 【課題三】以癌癥和衰老模型為主要研究對象，探討在細胞異常增殖過程中相關蛋白質群，如Mig-2信號通路的變化規(guī)律。通過對目的基因進行表達干預（過表達或沉默），從體外到體內深入研究候選蛋白質群對細胞增殖、細胞周期調控的影響。結合信號通路的特異性抑制藥物等分析目的基因表達干預后導致的新差異蛋白及所涉及的信號通路。采用TAP技術并結合質譜分析篩選和鑒定出差異蛋白的相互作用蛋白或蛋白復合體。利用穩(wěn)定同位素標記并結合高靈敏度的生物質譜鑒定技術，研究細胞核蛋白質和DNA片段上的修飾類型、修飾位點， 闡明其信號轉導機制及其在衰老過程中的功能。采用在體鑒定快速腫瘤細胞增殖、侵 襲和轉移的實驗系統(tǒng)，提高甄 別在細胞周期中調控異常增殖蛋白質群的效率。選擇調控細胞異常增殖的代表性新蛋白，建立其與腫瘤病人的相關性?！菊n題四】研究Hippo信號通路調控細胞增殖和細胞凋亡的分子機理，揭示Hippo信號通路核心分子對基因組穩(wěn)定性的調控機制，分析Hippo信號通路蛋白與微管結合蛋白的關系及其在調控細胞增殖和凋亡中的作用。在全基因組水平上通過干擾基因的表達（RNAi）篩選Hippo調節(jié)蛋白質群，并結合微陣列分析鑒定Hippo通路新的靶基因集團；通過上位分析（epistasis）和IP-Western 等方法在體內與體外研究 Hippo通路組 成分子間的動態(tài)互作；通過質譜分析鑒定蛋白修飾，特別是磷酸化修飾調控Hippo通路的分子及生物學意義；系統(tǒng)分析Hippo通路蛋白質組群在細胞內的定位情況及轉位意義；分析CYLD 和EB1等微管結合蛋白與有絲分裂、細胞增殖以及基因 組穩(wěn)定性之間的關系；通過蛋白共定位研究探討Hippo通路與PTEN調節(jié)基因組穩(wěn)定性的關系，從而探討多細胞生物在細胞周期失調而發(fā)生遺傳物質不穩(wěn)定的情況下如何對細胞命運進行調節(jié)。各課題組還將充分利用課題組三具備的大型蛋白質鑒定分析技術平臺對更多參與維持基因組穩(wěn)定性的蛋白質群進行大規(guī)模鑒定和分析。3. 可行性分析(1) 本項目的科研 隊伍以從事生物化學、分子生物學、細胞生物學、蛋白質組學、生物信息學等國家和部門重點實驗室、教育部985創(chuàng)新平臺為主體，集中了目前從事基因組穩(wěn)定性和細胞周期調控相關蛋白質群研究的優(yōu)勢科研團隊。其中，各課題負責人都是本領 域的專家， 親自設計各自的 課題并將指導項目的具體實施。(2) 本項目著眼于大 規(guī)模蛋白質組（群）而非單個蛋白的研究。2007年10月召開的國際蛋白質組學組織大會標志著從大規(guī)模技術性研究向差異和動態(tài)組學研究的趨勢。但迄今已有的技 術幾乎都限于檢測和比較蛋白的累積量。課題三近期自主建立的SiLAD 技術對蛋白真正表達水平差異的 測定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用穩(wěn) 定同位素同時摻入細胞核蛋白質和DNA上新添甲基的系統(tǒng)研究方法已成熟地用于本課題相關模型的研究中。這些新技術方法都是針對細胞調控中的蛋白質組（群）動態(tài)研究而開發(fā)的。本研究具備扎實的前期研究工作基礎和創(chuàng)新技術平臺，以及用于功能研究的基因敲除動物模型和高精確度的質譜分析鑒定蛋白質動態(tài)表達和蛋白質修飾平臺。良好的工作基礎和強大的蛋白質組學技術平臺為本課題研究計劃的順利進行提供了有力的保障。(3) 參加本項 目研究的各實驗室具備優(yōu)良的研究條件。同時，各課題間早已經形成了緊密的協(xié)作關系，各方面的研究相互交叉、 組成了一個有機的整體。 課題二中建立的基因敲除小鼠模型以及轉基因小鼠模型在國際上也具有領先地位，為其他課題順利實施提供了珍貴的活體動物模型。課題三的高通量蛋白質鑒定和分析平臺為其他各個課題組的研究分析提供了可靠、高效的技術平臺。（二）創(chuàng)新點1. 本項目瞄準國際前沿，面向國家需求，綜合利用多學科優(yōu)勢，集中 針對遺傳物質穩(wěn)定性相關蛋白質群的分子調控網絡和相互作用，展開多層面更又互相關聯(lián)的研究。2. 本項目將細胞周期的各個時期有機地整合在一起，通過研究各個環(huán)節(jié)相關的蛋白質群及其調控和相互作用機理而探討這些蛋白質群對細胞周期調控的分子機制，評價其作為有機整體和分子網絡對遺傳物質穩(wěn)定性的相關性，在此基礎上大規(guī)模鑒定和分析與細胞周期調控相關的各種蛋白質群，并探索這些蛋白質群之間的相互作用，構建與 細胞周期調控和基因組穩(wěn)定性維持相關的蛋白質組分子調控網絡。此外，還進一步研究當細胞周期失 調發(fā)生遺傳物質不穩(wěn)定后，多細胞生物作為有機整體利用何種機制對細胞命運進行決斷，從而綜合性評價細胞周期調控與基因組穩(wěn)定性的內在聯(lián)系和相關蛋白質群的功能和相互作用。3. 本項目在研究內容方面具有完全創(chuàng)新性：孔道春實驗室在裂殖酵母S. pombe發(fā)現(xiàn)了 DNA復制起始蛋白 —Sap1，他們證明 Sap1是DNA復制起始蛋白Cdc18結 合到DNA復制源上所必需的。康鐵邦教授在細胞周期和DNA 損傷檢測點中，發(fā)現(xiàn) 了一條新的調控通路（GSK-3β-Cdc25A），該通路在G1 、S期和G1-S 期轉換中起關鍵作用。尹玉新課題組研究設想PTEN對細胞周期有絲分裂形成獨特的調節(jié)，而 這種調節(jié)在國際上也是全新發(fā)現(xiàn)。 張宏權課題組發(fā)現(xiàn)跨膜受體整合素結合蛋白Mig-2是細胞跨過有絲分裂中期（Metaphase）所必須的，并證明這一作用是通過一個全新的Mig-2－ILK信號通路調控的。肖雪媛和紀建國課題組以腫瘤和衰老為實驗模型，研究新發(fā)現(xiàn) 的與細胞增殖異常相關蛋白的生物學功能及組蛋白修飾變化規(guī)律。而以此為 基礎構建靶蛋白表達干預后的交替多輪差異蛋白篩選策略。4. 本項目在研究方法方面也具有獨到之處，在國際上處于領先水平。尹玉新課題組在多年的研究基礎上， 發(fā)展了一系列體內、體外活體研究模型，例如小鼠基因敲除模型系統(tǒng)：他們已經成功敲除PAC1基因（p53下游的一個重要基因）并且建立了一系列PTEN條件基因敲除knock-in模型，通過這些模型檢測PTEN在腫瘤發(fā)生過程中如何調節(jié)有絲分裂，研究PTEN與相關蛋白質群作用，而這些作用可與特定小鼠模型的腫瘤發(fā)生直接關聯(lián)，從而更加直觀地評價PTEN調控有絲分裂的作用與腫瘤發(fā)生有無直接關系。此外，他們正在建立 轉基因小鼠模型預測某些重要蛋白過度表達是否可促進腫瘤發(fā)生。張宏權課題組首次在斑馬魚模型中建立了在3－7天內在體鑒定腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的實驗系統(tǒng)，為增殖異常的腫瘤細胞進行大規(guī)模體內評價提供了快速、經濟和方便的最新方法。肖雪媛課題組則首次提出使穩(wěn)定同位素同時摻入細胞核蛋白質和DNA上新添甲基的系統(tǒng)研究方法，從而可以快速、定量鑒定表觀遺傳修飾的動態(tài)變化， 這將有助于組蛋白修飾密碼及其作用機制的確定。（三）課題設置課題一：真核細胞DNA復制機理及細胞周期檢驗點在維持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用研究目標：本課題將研究真核細胞DNA復制及檢驗點維持遺傳物質穩(wěn)定性的機理，確定DNA 復制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及闡明它 們的生化功能；確定人細胞的Sap1同源蛋白；大規(guī)模確定新的DNA復制蛋白；闡 明Dna2維持DNA 復制叉穩(wěn)定的機理；闡明Cds1-Dna2的檢驗點通路，揭示 檢驗點在 維持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用。闡 明Cds1-Dna2的檢驗點通路，揭示檢驗點在維持復制叉穩(wěn)定的作用；鑒定G1、S期 細胞中新的受GSK-3β調控的基因或蛋白質 群及其機制和意義。研究內容：1. 確定Sap1的相互作用蛋白和人細胞的Sap1同源蛋白并闡明它們的生物功能和生化作用機理。采用下面三種方法確定Sap1相互作用蛋白。一是用遺傳的方法篩選Sap1溫度敏感株的抑制蛋白；二是直接從細胞內分離Sap1的蛋白復合體；三是用蛋白親和層析的方法分離Sap1的相互作用蛋白。2. 確定新的DNA復制蛋白在裂殖酵母S. pombe , DNA復制起始蛋白Cdc18的高表達導致DNA重復復制并最終使細胞死亡。如果另一個復制蛋白由于突變使得它的活性降低，該蛋白就能拮抗Cdc18的高表達導致的DNA重復復制從而使細胞能存活。用該方法已經篩選到了幾百個突變株，現(xiàn)正確定它們的突變基因，并進一步與課題組三合作，利用高通量蛋白質鑒定分析平臺研究新的DNA復制蛋白的相互作用及其生物學功能。3．闡明Cds1-Dna2的檢驗點通路已發(fā)現(xiàn)Dna2能防止停 頓的DNA復制叉倒轉，也發(fā)現(xiàn) Cds1調控Dna2和DNA的相互作用，但Cds1 和Dna2不直接相互作用。這暗示Cds1通過調控另一個蛋白達到促使Dna2結合到 DNA上。采用生化和遺傳的方法確定 該蛋白，并最終闡明Cds1-Dna2的檢驗點通路。4．鑒定新的 GSK-3β底物，及其機理和調控機制本課題組最近發(fā)現(xiàn)，在DNA損傷時GSK-3β 在S期的調控中也起重要作用。將用基因表達譜芯片或蛋白組學的方法，鑒定新的受GSK-3β調控的基因或蛋白質群，并挑選適當的功能基因或蛋白，在 細胞水平和整體水平（動物模型）進行分析、驗證，并探 討其作用機制及意 義。同 時，本課題組還發(fā)現(xiàn) GSK-3β可能通過磷酸化Cdh1調節(jié) APCCdh1的活性，從而調控有絲分裂的過程。本課題擬鑒定Cdh1在體內、外被GSK-3β 磷酸化的位點；探討GSK-3β 和Cdh1在 細胞周期調控、 DNA損傷修復中的作用。承擔單位：中山大學、北京大學課題負責人：康鐵邦，特聘教授，42歲, 中山大學腫瘤防治中心學術骨干：孔道春、張麗君等預算經費： 23.5%課題二：PTEN調節(jié)的蛋白質群在細胞有絲分裂中的作用研究目標：本課題旨在探討PTEN在有絲分裂過程中的地位和作用，首先了解PTEN調控其靶基因集團的機理，然后研究PTEN和有絲分裂相關蛋白質群的相互作用，第三建立活體動物模型以評價PTEN在維持遺傳物質穩(wěn)定性和抑制腫瘤中的作用，最后揭示PTEN與p53通路蛋白質群之間的網絡關系。研究內容：1. 檢測有絲分裂期間PTEN在維持著絲粒和關卡功能中所發(fā)揮的作用。揭示著絲粒中PTEN的精確定位；在體外和體內的Pten- 缺陷型細胞中確定PTEN缺失如何導致染色體凝集和集合障礙，著絲粒-微管相互作用受損以及紡錘體關卡應答障礙；觀察Pten-缺陷型細 胞中過度表達PTEN是否能校正染色體錯排和分離錯誤，以及恢復著絲粒功能和關卡應答。利用基因芯片技術鑒定出新的PTEN調節(jié)基因群并且深入了解其調控機理。采用染色質-免疫共沉淀（ChIP）方法確定PTEN與染色質之間的相互作用從而探討PTEN調控其靶基因表達的機理。2. 鑒定與PTEN相互作用的蛋白質群。我們已建立了成熟的蛋白質Pull-down分析系統(tǒng)，并且成功地發(fā)掘出與有絲分裂相關的蛋白激酶，如PLK-1和紡錘體運動相關的馬達蛋白，如EG5 。本 課題將利用這一成熟的系 統(tǒng)通過標記PTEN鑒定更多與有絲分裂相關的蛋白質群。通過傳統(tǒng)的蛋白質-蛋白質相互作用實驗（IP-western）、定向誘變、 熒光素酶分析等方法檢測PTEN 與這些新鑒定出的有絲分裂相關蛋白質群的物理性相互作用并且利用課題組三的蛋白質分析平臺鑒定PTEN與這些蛋白質群物理性相互作用的結構域及蛋白質修飾位點。3. 建立PTEN突變的小鼠模型，以評價PTEN在有絲分裂過程和維持基因組穩(wěn)定性中的重要性。在前期研究中已成功地建立了條件性PTEN189 knock-in小鼠模型，這些PTEN突變的小鼠以極高的頻率發(fā)生腫瘤。將利用這些模型評價PTEN在活體中調控細胞周期，有絲分裂及其維持基因組穩(wěn)定性的作用，并且衡量基因組不穩(wěn)定性與腫瘤發(fā)生的因果關系。4. 揭示PTEN與p53調節(jié)的蛋白質群之間的分子網絡。本課題組的前期研究結果顯示：PTEN對p53形成負調節(jié)，即失去PTEN可激活p53通路，如Apalf-1、PUMA和PAC1等，導致自 發(fā)性細胞死亡。我們將利用已建立的組織特異性PTEN基因敲除小鼠模型研究p53通路及其凋亡靶基因群如何對PTEN的功能失調產生應答，以此評價抑癌基因之間的分子網絡聯(lián)系及對化療藥物敏感性的影響，為臨床化療、藥物的篩選提供理論依據。承擔單位：北京大學、中山大學課題負責人：尹玉新，教授，49歲, 北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院學術骨干：張輝等預算經費： 29.5%課題三：細胞增殖異常模型中的相關蛋白質群及其調控網絡研究研究目標：本課題以腫瘤和衰老模型為主要研究對象，對前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉移及衰老密切相關蛋白進行生物學功能的研究，鑒定新的參與細胞周期G1和M期的蛋白并研究其在細胞異常增殖過程中的作用。從蛋白質群調控網絡水平上揭示細胞增殖調控失常的分子機制。研究內容：1、對已初步選定的一些與異常增殖特異相關的關鍵蛋白，如 S100A 家族、Mig-2、和 PHP14 等，利用基因干擾技術和課題二中所建立的轉基因小鼠和條件性基因敲除等平臺，從體外培養(yǎng)細胞到體內動物模型驗證并研究其在腫瘤發(fā)生與轉移以及衰老過程中的生物功能及其變化規(guī)律。2、利用 SiLAD 等動態(tài)蛋白質組學方法，篩選鑒定腫瘤或衰老相關蛋白的相互作用蛋白及其在干預靶蛋白情況下的動態(tài)變化規(guī)律。結合信號通路特異性抑制劑等手段探索和確定其所參與的信號轉導通路，特別是與 PTEN 和 p53 通路的關系。闡明其導致調控異常的分子機制。3、利用前期研究所建立的體內快速檢驗異常增殖的與腫瘤相關的蛋白質群的斑馬魚技術平臺，鑒定出 調控腫瘤細胞異常增殖的重要蛋白質群，并在臨床病人中建立相關性驗證，以明確其在腫瘤診斷、 預防和治 療中的意義，以及作 為潛在藥物靶標的可能性。4、進一步改進和優(yōu)化已初步建立的，可對組蛋白基因調控區(qū)的甲基化等修飾及修飾位點進行系統(tǒng)性定量鑒定的新技術，進而探索特殊修飾在細胞增殖調控異常中的作用。力求發(fā)現(xiàn) 和鑒定１－２個關鍵核蛋白質修飾類型及有可能用于新藥開發(fā)的重要靶標。承擔單位：北京師范大學、北京大學課題負責人：張宏權，教授，46歲，北京大學學術骨干：肖雪媛、紀建國等預算經費： 23.5%課題四：調控細胞增殖與細胞凋亡的分子機制研究研究目標：本課題將主要研究 Hippo 信號通路調控細胞增殖和細胞凋亡的分子機理；分析微 CYLD 和 EB1 等微管結合蛋白 調控細胞有絲分裂進程的分子機制。研究內容：1、Hippo 信號通路組成蛋白間的動態(tài)互作。通 過上位分析（epistasis）和 IP-western 等方法全面調查 Hippo 信號通路各組成蛋白間動態(tài)的互作及其對 Hippo信號傳遞的意義；通過質譜分析鑒定 Hippo 通路蛋白的修飾類型，特別是激酶Hpo 和 Wts 底物及其磷酸化位點的鑒定及其分子與生物學意義。2、鑒定新的靶蛋白。利用已有的 Yki 轉基因動物模型，通過 micro-array 比較表達譜的差異，鑒定新的 Yki 靶基因，并通 過上位分析（epistasis）確定其在Hippo 信號通路中的作用。3、鑒定 Hippo 通路調控分子及分析通路激活機制。與課題組三合作，利用高通量蛋白質分析平臺和已制備的 Hpo 磷酸化 Wts 的磷酸化抗體，通過小分子RNA 干 擾基因表達檢測 Wts 的磷酸化水平的變化， 鑒定新的 Hippo 通路調控因子、特別 是上游調控分子并分析其功能，分析通路的激活機制。4、系統(tǒng)分析 Hippo 通路蛋白質組群在細胞內的定位與轉位。高速離心分離細胞組分，確定 Hippo 通路蛋白在細胞質膜、 細胞質 、細胞核以及細胞器的定位；在細胞整體水平上觀察通路蛋白的定位與轉位，分析引起蛋白轉位的因素與意義；Wts 、Mats 和 Wts 為中心體定位蛋白，均可以 調 控中心體的復制與染色體的分離，從而影響基因組的穩(wěn) 定性。我 們將與課題組二合作，探討三者之間的相互關系，為 Hippo 信號通路影響基因組穩(wěn)定性提供分子水平上的證據。5、探索 Hippo 信號通路與 Rassf、EB1、CYLD 等微管結合蛋白之間的關系，解析上述各蛋白協(xié)同或獨立調控細胞增殖與凋亡的分子機理。承擔單位：南開大學課題負責人：吳世安，教授，40歲，南開大學生命科學學院特聘教授學術骨干：周軍、朱玉山等預算經費： 23.5%（四）各課題間的相互關系，以及與項目總體目標和五年目標的關系根據總體目標的要求，本項目的中心思想是維持細胞增殖與分裂過程中遺傳物質的穩(wěn)定性，而這一穩(wěn) 定性的維持有賴于細胞周期的精細調節(jié)，在此過程中不同蛋白組群相互作用、相互影響和相互調節(jié)。本 課題組將根據這個原則進行分解、設計 ，了解與探索在細胞周期各個階段蛋白質活 動的規(guī)律，探索信息 傳導在細胞周期調節(jié)過程中的重要作用，評價細胞生存和死亡調控機制的價值。各個項目圍繞細胞周期的不同階段或不同檢驗點，選擇特定的研究渠道進行機制研究和探索。各個課題之間相互 聯(lián)系、互相促 進，旨在實現(xiàn) 本項目的總體目標，即從與遺傳物質穩(wěn)定性相關蛋白質群這一關鍵科學問題出發(fā)，在細胞周期的各個環(huán)節(jié)探討相關蛋白質群的分子調控機制以及相互作用網絡。本項目五年目標的完成則具體表現(xiàn)在以上所述四個課題的研究計劃中：課題一、著重研究DNA復制過 程中蛋白質群的相互作用和 調節(jié)，同時研究DNA復制期檢驗點在維持遺傳物質穩(wěn)定性中的作用；課題二、了解有絲分裂過程中PTEN調節(jié)的蛋白質群的相互作用和調節(jié)機制，還將進一步探討PTEN與p53的分子抑癌網絡。以上兩個課題主要探 討細胞正常生長分裂過程中的兩個重要事件：DNA復制和有絲分裂中相關的蛋白質群及其作用機制。課題三則利用現(xiàn)有的蛋白質分析技術平臺來對細胞異常增殖中涉及的各種蛋白質群進行系統(tǒng)的大規(guī)模的鑒定和分析，以達到全面理解細胞周期調節(jié)中各個系統(tǒng)蛋白質相互作用的機制和形式。此外，細 胞周期的完善與精細調節(jié)體現(xiàn)在遺傳 物質穩(wěn)定性的保持。如果 細胞周期不能進行正確調節(jié)，多 細胞系統(tǒng)將通過信號傳遞及細胞生長調控來實現(xiàn)細胞的存亡。課題四將研究不同細胞信號通路如何對細胞的生存和死亡進行精細調控。因而，以上四個課題相互關聯(lián)，層次遞進，從作為中心的遺傳物質穩(wěn)定性，到細胞周期各階段的精確調節(jié)，到 細胞周期失調導致細胞異常增殖，再到異常增殖導致的細胞信號通路的改變對細胞生物學功能的影響。這些從細胞周期衍生出來的變化，讓細胞必須做出抉擇：生或死；正常增殖或發(fā)生腫瘤。課題組間在技術平臺層面還存在廣泛的聯(lián)系和互助。課題一的高精度蛋白分離技術將會用于所有課題所面臨的蛋白質純化和分析的需求；課題二的基因敲除小鼠模型系統(tǒng)和課題三的斑馬魚腫瘤轉移模型系統(tǒng)可為其它課題組提供珍貴的活體動物模型，同時課題 三建立的快速鑒定調控細胞異常增殖蛋白質群的動物在體技術平臺，將大大加速 對四個課題研究的與遺傳物質穩(wěn)定性相關蛋白質群的功能研究，并結合不同信號通路的在體研究，有助于快速揭示這些蛋白質群的作用機制；課題四的果蠅細胞快速增殖模型和轉基因小鼠模型可用于測試各個課題組鑒定出的新的蛋白質群的功能。四、年度計劃第一年：研究內容1. 篩選與 Sap1、Cds1 和 Dna2 相互作用的蛋白，并且大規(guī)模鑒定和 DNA 復制有關的蛋白。2. 建立穩(wěn)定高表達 GSK-3β或 RNA 干擾 GSK-3β的 Hela 細胞系。3. 確定 TAP 的最佳條件，以便最大限度地 純化出 GSK-3β相互作用蛋白。4. 基因芯片法篩選出差異基因群，該基因群可能在轉錄水平直接或間接受GSK-3β的調 控。5. 著手研究 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的具體位點，及其意義。6. 創(chuàng)建一系列 GFP-PTEN 質粒，以使其在結構上具有 AcGFP1 編碼序列。將 這些 pAcGFP 載體轉染 Pten+/+ MEFs 或 HeLa 細胞。對細胞周期中不同時期的細胞進行分析以獲得 PTEN 動態(tài)定位的足夠信息。7. 在含有野生型 PTEN 和 PTEN 缺陷型的不同細胞系中對動粒功能進行分析。8. 建立 PTEN 敲除 MEFs 系統(tǒng)和 PTEN 誘導表達系統(tǒng)。通過 Western Blot 和Northern 分析檢測 PTEN 缺失和 PTEN 誘導表達的細胞中 p53 蛋白及其mRNA 的水平。9. 通過基因表達干預等方法從體內外系統(tǒng)研究與肺癌發(fā)生和轉移密切相關蛋白 S100A7、S100A11 和 PHP14 等的生物學功能。10. 建立神經細胞衰老和衰老模型，制備不同發(fā)育或分化階段的樣品材料，進行亞細胞器分級實驗，提取關鍵蛋白質組分。11. 在 mRNA 和蛋白質水平核實鑒定 Mig-2 上調的促 腫瘤生長和侵襲轉移的蛋白質群，并在腫瘤病人標本上建立相關性。12. 利用微陣列方法鑒定 Hippo 通路靶蛋白集團。13. 合成雙鏈 RNA，構建果蠅 RNAi 文庫。14. 完成 Hippo 通路主要已知組成蛋白如 Hpo、Sav、Wts、Mats、Yki 等及微管結合蛋白蛋白 Rassf、CYLD、EB1 等 GFP 融合蛋白表達 載體的構建，分析上述蛋白的細胞內定位、共定位與轉位情況。15. 分析微管結合蛋白對細胞周期進程的影響，檢測微管結合蛋白在腫瘤和對照組織中表達水平的變化及其表達對反映細胞生長或死亡的克隆形成率的影響，并通過 BrdU 整合實驗等，分析微管 結合蛋白表達對細胞增殖的影響。16. 制備并純化 Wts 磷酸化抗體。預期目標1. 質譜確定和 Sap1 相互作用的候選蛋白。篩選得到一些和 Cds1 和 Dna2 相互作用的蛋白。篩選得到~100 個突變株。并開始突變株的形態(tài)分析、開始突變株突變基因的確定。2. 分別得到 3 株以上穩(wěn)定高表達 GSK-3β或干擾 GSK-3β的 Hela 細胞系。3. 初步確定 TAP 的最佳條件.4. 篩選出干擾 GSK-3β后表達差異的基因群。5. 確定 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的具體位點，初步確定 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的意義。6. 揭示動粒中 PTEN 的精確定位。7. 確定 PTEN 缺失是否會導致染色體凝集和集合障礙，動粒-微管相互作用受損以及紡錘體檢驗點應答障礙。8. 完成不同 PTEN 狀態(tài)下 p53 蛋白及其 mRNA 水平的 測定分析，確定 PTEN 如何控制 p53 轉錄。9. 確認 S100A7、S100A11 和 PHP14 在肺癌發(fā)生和/或發(fā)展中的生物學作用。10. 獲得不同發(fā)育和衰老階段的亞細胞器樣品。11. 選擇 2-3 個 Mig-2 上調的與腫瘤增殖和侵襲有關的轉錄因子，闡明其調控機制。12. 得到 Yki 過量表達后靶蛋白表達增加與減少的順序列表，分析得到 3-5 個候選蛋白用于進一步分析。13. 完成約 5，000 個果蠅基因雙鏈 RNA 的制備。14. 獲得 Hippo 通路主要組成蛋白細胞內定位、共定位和轉位情況，完成對 Hippo通路與微管結合蛋白相互作用分子網絡的解析。15. 獲得微管結合蛋白對參與調控細胞增殖與凋亡機制的了解。16. 得到 Wts 磷酸化抗體。第二年：研究內容1. 用體外生化方法，驗證和 Sap1 相互作用的蛋白。著手開展這些蛋白基因的突變株的篩選。開始篩選人細胞的 Sap1 同源蛋白。2. 對第一年篩選的突變株進行形態(tài)分析，確定突變株的突變基因。DNA 序列分析確定突變基因的突變位點。序列對比分析這些基因表達的蛋白及可能的功能域。3. 體外驗證和 Cds1 及 Dna2 相互作用的蛋白。研究 Cds1 和 Dna2 通路的中間蛋白。著手開始篩選這些蛋白的突變株并開始功能分析。4. 利用生物信息學找出其中與細胞周期、DNA 損傷監(jiān)測 點的調控或與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的基因群。5. 利用 RT-PCR 在翻譯水平驗證該基因群；利用 Western blot 在蛋白水平上驗證。6. 以 TAP 大規(guī)模純化 GSK-3β高表達細胞 Hela 細 胞系與對照 Hela 細胞系裂解蛋白，SDS-PAGE 檢測差異蛋白群，LC-MS 以及生物信息學鑒定出差異蛋白群。7. 深入探討 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的對細胞周期的影響及其意義。8. 將 pcDNA3/PTEN 轉染 Pten-/- MEFs 并且通過 Western 分析證實異位 PTEN表達，通過免疫熒光法和活細胞成像對上述細胞中的染色體排列和分離進行監(jiān)測。9. 采用 epitope-tagging 策略從人類乳癌 MCF-7 細胞中分離純化在核內與 PTEN存在特異性相互作用的新的有絲分裂因子。對所得蛋白進行質譜分析后搜索蛋白數據庫進行鑒定。10. 采用染色質免疫共沉淀法（ChIP）檢測 PTEN 與 p53 啟動子 DNA 物理上的關聯(lián)。熒光素酶分析法檢測 PTEN 對 p53 啟動子的轉錄調控。進行 Dnase I 指紋圖譜分析，通過核心指紋圖譜系統(tǒng)精確限定 PTEN 與 p53 啟動子的結合區(qū)域。在 p53 啟動子區(qū)域構建一系列的缺失來縮小 PTEN 結合的最小的必需序列。11. 在第一年工作的基礎上，采用 TAP 技術對 S100A7、S100A11 和 PHP14 等相互作用蛋白或蛋白復合體組分進行篩選，并對獲得的候選蛋白進行質譜鑒定。通過免疫共沉淀等方法對其中感興趣的候選蛋白進行驗證。12. 對不同階段細胞進行穩(wěn)定同位素定量標記研究，收集研究材料進行亞細胞器分級，初步分析標記效率和蛋白質表達情況，利用質譜鑒定部分蛋白質。13. 通過免疫共沉淀并結合質譜技術，發(fā)現(xiàn)新的 Mig-2 相互作用蛋白質、制備抗體，揭示 mig-2 本身調控腫瘤細胞增殖和侵襲的分子機制。14. 通過免疫組化分析的方法在體內驗證 Hippo 通路調控新靶蛋白的表達并確定其參與的生物學過程。15. 合成雙鏈 RNA，構建果蠅 RNAi 文庫。16. 利用果蠅 RNAi 文庫、通 過 western blotting 方法觀察 Wts 磷酸化水平的變化篩選 Hippo 通路調控蛋白。預期目標課題一：1. 確定和 Sap1 相互作用的蛋白。得到 1 或 2 個和 Sap1 相互作用的蛋白的基因條件突變株。得到和人細胞 Cdc6 蛋白相互作用的候選蛋白。2. 完成突變株的形態(tài)分析。 完成突變株的突變基因的確定。 完成序列對比分析及蛋白功能域的確定。3. 確定 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白。敲除它 們的基因。完成突變株的形態(tài)分析。4. 驗證出 3-5 個與細胞周期、DNA 損傷監(jiān)測點的調控或與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關受 GSK-3β直接或 間接調控的基因。5. LC-MS 鑒 定 5-10 個 TAP 純化的差異蛋白。6. 確定 GSK-3β磷酸化 Cdh1 的對細胞周期的影響及其意義。7. 確定在 Pten 缺陷型細 胞中過度表達 PTEN 是否能校正染色體錯排和分離錯誤，以及恢復動粒功能和檢驗點應答。8. 分離純化若干個與 PTEN 相互作用的有絲分裂相關蛋白，并查詢其基本生物功能。9. 確定 PTEN 調節(jié) p53 轉錄的分子機制。10. 獲得若干個 S100A7、S100A11 和 PHP14 的相互作用蛋白或蛋白復合體組分。將其中一些蛋白將申請專利。11. 將穩(wěn)定同位素標記進入細胞各亞細胞器，獲得蛋白質的動態(tài)表達數據。12. 獲得 Mig-2 調控的新信號通路并建立相關信號通路與腫瘤病人的相關性。13. 確定 3-5 個候選靶蛋白在 Hippo 通路調控細胞增殖與凋亡中作用。14. 完成另外約 5，000 個果蠅基因雙鏈 RNA 的制備。15. 完成 Hippo 通路調控蛋白的篩選，分析選擇 3-5 個候選基因用于下一步分析。16. 培養(yǎng)研究生 8 名，培養(yǎng)博士后 4 名。 發(fā)表 IF>10 的論文 4 篇，IF>5 的論文 16篇。申請專利 4 項。第三年：研究內容課題一：1. 開始 Sap1 相互作用蛋白的功能分析。驗證和人細胞 Cdc6 相互作用的蛋白。2. 研究這些蛋白在細胞生長過程中的動態(tài)變化。研究它們是否是 DNA 復制必需的蛋白。研究它們是作用于 DNA 復制起始階段還 是 DNA 合成延長階段。3. 著手開展研究 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維 持 DNA 復制叉穩(wěn)定性中的作用。4. 研究 3-5 基因芯片篩選的個蛋白在翻譯水平上受 GSK-3β調控的方式及其機理（直接調控還是間接調控）。5. 評價該 3-5 個蛋白對細胞周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控的作用，或對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。6. 細胞水平驗證 TAP-LC-MS 發(fā)現(xiàn)的 GSK-3β相互作用蛋白的相互作用（免疫共沉淀實驗、GST pull-down 實驗等）7. 從 PTEN+/+ MEFs 和 PTEN-/- MEFs 中提取 RNA，逆 轉錄為 cDNA，采用生物素標記探針對芯片進行雜交。比較整體基因表達譜與 PTEN 功能的關系。8. 采用細菌表達的蛋白（GST-PTEN，GST 和候選蛋白）進行體外 GST pull-down分析。建立 HA-標記的鑒定蛋白細胞系，在 該細胞系中，或瞬時轉染 PTEN 表達載體及 HA-標記的鑒定蛋白的細胞中進行體內免疫沉淀和 western blot 分析。9. 構建含有 PTEN 磷酸酶活性失活的哺乳動物表達質粒，檢測 p53 的產生是否依賴于 PTEN 磷酸酶活性，同時檢測存在或缺失 PTEN 時 p53 是否發(fā)生活化。利用免疫沉淀（IP-Western）檢測 AKT 和 p53 之間的物理相互作用。10. 采用免疫共沉淀等方法對候選的相互作用蛋白進行驗證，從中選取 1-2 個感興趣蛋白或是功能未知蛋白，通過基因轉染等方法對其進行生物學功能分析。11. 利用多種質譜系統(tǒng)如 MALDI TOF/TOF MS 和 LC-MS/MS 系統(tǒng)鑒定不同衰老階段的蛋白質動態(tài)表達和修飾，鑒定修飾位點和修飾類型，進行氧化修飾和組蛋白質及和蛋白質修飾分析。12. 通過蛋白質相互作用技術，結合使用抑制劑和細胞實時圖像技術，揭示 Mig-2調控細胞周期 M-entry 和 Spindle assembly 的分子機制。13. Hippo 通路候選調控蛋白體內外功能分析。構建候選蛋白轉基因和敲基因動物模型，觀察其表型特點；利用免疫共沉淀等方法確定候選蛋白與 Hippo 通路已知蛋白之間的相互作用。14. 通過細胞共轉染、蛋白分離純化和質譜分析鑒定 Hpo 磷酸化 Sav 的關鍵磷酸化位點，構建關鍵位點突變的轉基因和敲入（knock-in）果蠅模型，分析磷酸化位點的功能。15. 分析 Hippo 信號通路主要蛋白與線粒體功能的相互關系，如 Hippo 通路蛋白與線粒體蛋白的共定位情況、Hippo 通路對線粒體功能的影響、線粒體對Hippo 通路激活機制的影響。16. 整理分析數據，撰寫論文。預期目標1. 確定 Sap1 相互作用蛋白是否在 DNA 復制起始中起必需作用。 驗證和確定人細胞 Cdc6 相互作用的蛋白，即人 細胞 Sap1 的同源蛋白。2. 確定這些和 DNA 復制過程相關蛋白在 DNA 復制過程中的作用階段。3. 確定 Cds1 和 Dna2 之間的通路。4. 初步闡明 5-10 個基因在翻譯水平上受 GSK-3β調控的方式及其機理。5. 初步闡明 3-5 個受 GSK-3β調控的基因對細胞周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控的作用，或對腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展中的作用。6. 驗證出 3-5 個與 GSK-3β相互作用的蛋白。7. 完成基因芯片篩選分析，鑒定出若干由 PTEN 調節(jié)的靶基因。8. 驗證第二年通過分離純化鑒定的若干 PTEN 相關蛋白與 PTEN 的相互作用是否為直接的。9. 完成 PTEN 磷酸化與 p53 活性的相關性分析以及 AKT 與 p53 相互作用的分析，確定 PTEN 是否間接調節(jié) p53 通路。10. 初步探究 S100A7、S100A11 和 PHP14 對肺癌發(fā)生和/或發(fā)展的分子機理。11. 獲得細胞核蛋白質動態(tài)修飾、修飾類型、修 飾位點信息，為進一步功能分析打下基礎。12. 闡明 Mig-2 調控細胞周期和基因組不穩(wěn)定性的新分子機制。13. 得到 3-5 候選調控蛋白轉基因與敲基因果蠅動物模型，根據表型初步判斷其生理功能；確定候選蛋白與 Hippo 通路蛋白的相互作用。14. 確定 Hpo 磷酸化 Sav 的關鍵位點與磷酸化的生物學意 義。15. 確定 Hippo 通路蛋白特別是 Hpo 與線粒體功能的相互關系。16. 培養(yǎng)研究生 12 名，培養(yǎng)博士后 4 名。 發(fā)表 IF>10 的論文 4 篇，IF>5 的論文 16篇。申請專利 4-8 項。第四年：研究內容1. 開始研究 Sap1 相互作用蛋白在 DNA 復制起始中的機理研究。 研究人細胞Sap1 在 DNA 復制起始中的作用。2. 開始新確定的 DNA 復制蛋白在 DNA 復制起始及延長階段的作用機理研究。3. 開展研究 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維持基因 組穩(wěn)定性中的作用。4. 進一步研究受 GSK-3β調控的基因對細胞周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控，或對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用、意義及其機理。5. 鑒定各個蛋白與 GSK-3β相互作用的肽段或 GSK-3β對各個蛋白磷酸化的位點。6. 研究各個與 GSK-3β相互作用蛋白對細胞對周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控，或對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用，以及與 GSK-3β對該 蛋白功能的影響。7. 采用染色質免疫共沉淀法（ChIP）檢測 PTEN 與染色質物理上的關聯(lián)，隨后以熒光素酶分析法檢測 PTEN 對靶基因啟動子的轉錄調控。進行 Dnase I 指紋圖譜分析，通過核心指紋圖譜系統(tǒng)精確限定 PTEN 與靶基因啟動子的結合區(qū)域。基于指紋圖譜分析數據，在啟動子區(qū)域進行一系列的缺失來縮小 PTEN結合的最小的必需序列。8. 利用課題組三的蛋白質分析平臺鑒定 PTEN 與有絲分裂相關蛋白質群的物理性相互作用的結構域及蛋白質修飾位點。進一步通過 RNAi 等分析已驗證蛋白的功能特性。9. 建立條件性 PTEN knock-in 小鼠模型。10. 在不同 PTEN 和 p53 狀態(tài)的乳腺癌細胞株中，通過 Western 分析檢測 p53、 Apaf-1、PUMA 和 PAC1 的基本表達水平。在 PTEN siRNA 以及 PTEN189 突變的細胞株中再次檢測 p53、Apaf-1、PUMA 和 PAC1 的表達水平。11. 采用基因表達芯片和/或雙向電泳等技術篩選 S100A7、S100A11 和 PHP14 基因沉默后，對其所調控的基因或蛋白群表達的影響。12. 分析關鍵蛋白質表達和修飾變化，激起涉及關鍵生物學機制和信號傳導途徑，對關鍵蛋白質通過基因表達干預、利用 RNAi 和小分子化合物進行抑制和/ 或活化進行功能研究。13. 研究 Mig-2 調控的多重細胞信號通路及其協(xié)同整合調控腫瘤侵襲性生長的分子機制，特別要關注 Mig-2 信號通路與 Wn、Hedgehog 及生長因子信號通路中的交互作用。14. 利用構建的轉基因以及敲基因果蠅模型，通過上位分析（epistatsis ）探討候選調控蛋白與已知 Hippo 通路蛋白的遺傳學關系，并結合前述所得體外相互作用分析通路激活機制。15. 探討 Hippo 通路蛋白直接影響基因組穩(wěn)定性的機理，分析通路蛋白如Wts、Mats 等與 PTEN 和 P53 等蛋白之間的關系。16. 結合果蠅研究，選擇 1-2 種候選調控蛋白構建誘導型轉基因小鼠模型，探討候選基因在哺乳動物中的功能保守性。17. 整理分析數據，撰寫論文。預期目標1. 確證 Sap1 相互作用蛋白在 DNA 復制起始中的作用。 確證人細胞 Sap1 在DNA 復制起始中的作用。2. 初步確定新的 DNA 復制蛋白在 DNA 復制中的作用機理。3. 初步確定 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維持復制叉的 穩(wěn)定性、 DNA 修復、及基因組穩(wěn)定性的作用機理。4. 深入闡明 3-5 個受 GSK-3β調控的基因對細胞周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控的作用，或對腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展中的作用。5. 鑒定 3-5 個與 GSK-3β相互作用蛋白的具體作用肽段或位點。6. 初步闡明 3-5 個與 GSK-3β相互作用蛋白對細胞對周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控，或對腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展中的作用，以及與 GSK-3β相互作用后對該蛋白功能的影響。7. 對之前通過基因芯片鑒定的 PTEN 靶基因，確定 PTEN 調控這些靶基因表達的機理。8. 完成 PTEN 及其相關蛋白質群的功能分析，評價與 PTEN 相互作用的蛋白質群在控制有絲分裂中的重要性。9. 獲得條件性 PTEN knock-in 小鼠。10. 完成在 PTEN 缺失或突變的狀態(tài)下 p53 通路蛋白表達水平的測定分析，證實PTEN 功能障礙能引發(fā) p53 通路活化。11. 揭示 S100A7、S100A11 和 PHP14 抑制肺癌細胞生長和/或轉移的信號通路。12. 獲得和蛋白質動態(tài)變化所涉及的關鍵生物學機制，分析相互作用蛋白質。13. 揭示 Mig-2 信號通路與 Wnt、Hedgehog 及生長 因子信號通路的蛋白質群之間在調控腫瘤侵襲性生長中協(xié)同整合作用。14. 闡明候選蛋白在 Hippo 通路中的位置與激活通路的分子機制。15. 確定 Hippo 通路與基因組穩(wěn)定性之間的直接關系。16. 得到 1-2 種候選蛋白的轉基因小鼠模型。17. 培養(yǎng)研究生 12 名，培養(yǎng)博士后 4 名。 發(fā)表 IF>10 的論文 4 篇，IF>5 的論文 16篇。申請專利 4-8 項。第五年：研究內容1. 多方面深入研究 Sap1 相互作用蛋白在 DNA 復制起始中的作用機理。探 討人細胞 Sap1 在 DNA 復制起始中的作用。2. 深入研究新的 DNA 復制蛋白在 DNA 復制起始及在復制叉生化反應中的機理。3. 探討 Cds1 及 Dna2 相互作用蛋白在維持基因組穩(wěn) 定性中的作用。4. 進一步研究各個與 GSK-3β相互作用蛋白對細胞周期調控、DNA 損傷監(jiān)測點調控，或對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用，意 義及其機理，以及與 GSK-3β相互作用后對該蛋白功能的影響、意義及其機理。5. 在從 PTEN189 小鼠和